QuEChERS樣品制備方法應(yīng)用于LC/MS和LC/UV測定橙汁中多菌靈 和其他康唑類殺菌劑

　　□ 沃特世 供稿

　　本文討論了橙汁中康唑類殺菌劑(包括多菌靈)的樣品制備策略。首先，使用QuEChERS方法的DisQuE產(chǎn)品進行樣品制備，用以檢測各種水果、蔬菜和果汁中的殺蟲劑含量。結(jié)合QuEChERS方法，UPLC/MS/MS可以輕易檢測出10μg/L(ppb)包括多菌靈在內(nèi)的5種康唑類殺菌劑，且無需進行進一步的樣品制備操作。QuEChERS提取液可以作為前體樣品，然后進一步凈化并使用液相色譜UV檢測器分析其中ppb水平的多菌靈和其他康唑類殺菌劑目標分析物。利用Oasis MCX小柱進行固相萃取(SPE)可對待測物進行富集，并減少基質(zhì)干擾。該方法通過使用配備UV檢測的液相色譜可完成多菌靈樣品在低ppb水平的準確定量。Oasis MCX凈化操作雖然不是UPLC/MS/MS分析的必需步驟，卻能夠減少基質(zhì)效應(yīng)而得到更加潔凈的提取物。因此，使用QuEChERS方法DisQuE產(chǎn)品制備的樣品適用于UPLC/MS/MS直接分析，及經(jīng)混合模式SPE富集和凈化之后的HPLC/UV測定。

　　沃特世解決方案

　　Xevo® TQ質(zhì)譜;ACQUITY UPLC® H-Class系統(tǒng);ACQUITY UPLC BEH C18柱;XBridgeTM BEH C18XP色譜柱;DisQuETM試劑袋產(chǎn)品;Oasis® MCX萃取柱;LCMS認證樣品瓶。

　　實驗

　　用作質(zhì)譜分析的UPLC條件

　　系統(tǒng)：ACQUITY UPLC H-Class;

　　色譜柱：ACQUITY UPLC BEH C18，2.1×100mm，1.7μm(部件編號：186002352);

　　進樣量：10μL;

　　溫度：40℃;

　　流動相A：0.1%NH4OH水溶液;

　　流動相B：0.1%NH4OH甲醇溶液;

　　流速：0.40mL/min;

　　梯度：流動相B初值為10%，4分鐘內(nèi)線性梯度增至90%，保持5分鐘，降回至10%B，持續(xù)5.1分鐘。保持并再平衡7分鐘。

　　用作XP色譜柱UV分析的HPLC條件

　　系統(tǒng)：ACQUITY UPLC H-Class;

　　檢測：PDA檢測器;

　　色譜柱：XBridge C18XP，4.6×100mm，2.5μm(部件編號：186006039);

　　進樣量：50μL;

　　溫度：40℃;

　　流動相A：20mm磷酸鉀水溶液(pH6.8);

　　流動相B：乙腈;

　　流速：1.3mL/min;

　　梯度：25%B的初值保持3.4分鐘，9.7分鐘內(nèi)線性梯度增至65%B，保持11.0分鐘，然后線性梯度增加至95%，保持13.0分鐘，之后降回至25%B，持續(xù)13.2分鐘。保持并再平衡18.3分鐘。

　　樣品制備

　　使用QuEChERS方法進行初步提?。簩?5mL橙汁樣品加到50mL的離心管內(nèi)。加入15mL1%乙酸乙腈(ACN)溶液，振搖1分鐘。加入為AOAC QuEChERS方法準備的DisQuE試劑(部件編號186006812)，劇烈搖勻1分鐘。然后在3000rpm下離心5分鐘。對不使用固相萃取，直接進行UPLC/MS/MS分析的樣品，將0.5mL上清液加水稀釋至1.0mL。

　　SPE凈化：使用Oasis MCX小柱的固相萃取方法可對堿性化合物(例如康唑類殺菌劑)進行凈化。準備進行LC/UV分析前(如果需要凈化樣品)，從QuEChERS提取物中取2mL上清液，加入6mL0.01M HCl水溶液，然后混均。使用一根3cc Oasis MCX柱進行固相萃取凈化操作。QuEChERS提取液以酸性水溶液稀釋，從而提高混合模式SPE保留，同時水溶液稀釋增加了反相保留。

　　質(zhì)譜條件

　　質(zhì)譜儀：Waters® Xevo TQ。

　　結(jié)果與討論

　　使用QuEChERS方法能夠在UPLC/MS/MS分析之前有效地萃取康唑類殺菌劑。其中的一種殺菌劑——多菌靈，未經(jīng)注冊卻被確證出現(xiàn)在市售的橙汁樣品中。本實驗通過質(zhì)譜分析實現(xiàn)了該化合物在1ppb的水平上的確證，同時LC/UV檢測限也達到了10ppb水平。研究結(jié)果顯示，使用了QuEChERS樣品制備方法的DisQuE產(chǎn)品，不僅能夠?qū)颠蝾悮⒕鷦┻M行有效的UPLC/MS/MS分析，而且通過適當?shù)膬艋僮鞑襟E，還能使用LC/UV檢測出較低ppb水平的殺菌劑。

　　以上測定結(jié)果也驗證了一個重要的結(jié)論：對于大部分基質(zhì)中存在的多種殺菌劑及相關(guān)化合物，QuEChERS方法是一種非常有效的樣品制備技術(shù)。隨后的樣品凈化程度完全取決于分析人員的需求、檢測方法的靈敏度和特異性。分析過程表明，雖然SPE凈化步驟只是推薦性而非高效率的UPLC/MS/MS分析所必需的過程，但是另一方面，要實現(xiàn)低ppb水平的多菌靈LC/UV測定，則必須進行包括隨后Oasis MCX的固相萃取過程。

　　不使用SPE凈化的UPLC/MS/MS

　　分析

　　通過對每種殺菌劑的10ppb加標(多菌靈為1ppb)橙汁樣品的UPLC/MS/MS重現(xiàn)圖譜的分析，使用外標計算方法得到的五點基質(zhì)匹配曲線(未示出)中，所有康唑類殺菌劑的相關(guān)系數(shù)(r2)都大于0.995。根據(jù)橙汁基質(zhì)中制備的3份平行樣品得到的結(jié)果測定康唑殺菌劑的回收率，其范圍為92%～110%且相對標準偏差(%)小于7%。回收率實驗的具體操作方法：分別在QuEChERS萃取之前和萃取后的果汁樣品中進行殺菌劑加標，并將兩者所得的MRM峰面積進行對比。基質(zhì)效應(yīng)(抑制比%)由QuEChERS萃取后的殺菌劑加標上清液的MRM峰面積與用50∶50乙腈/水制備的等量殺菌劑標準品峰面積進行對比得出。

　　使用SPE凈化的LC/UV分析

　　使用SPE凈化的LC/UV回收率與100ppb水平加標樣品的UPLC/MS/MS分析結(jié)果相似。圖1是使用XP色譜柱的LC/UV方法測定抑霉唑、腈苯唑和苯醚甲環(huán)唑所得的色譜圖。多菌靈和噻菌靈在可見的280nm至300nm處缺少有效發(fā)色團;然而在220nm處卻能達到很高的靈敏度，這在很大程度上是因為使用了紫外可穿透的流動相(磷酸鉀)。

　　已測樣品的分析

　　圖2是對已測橙汁樣品分析得到的LC/UV色譜圖。可看出使用Oasis MCX小柱可獲得高水平樣品凈化效果。上方為未使用SPE凈化的色譜圖，下方為使用Oasis MCX凈化后的色譜圖。圖3是同時使用QuEChERS方法和Oasis MCX小柱凈化后得到的色譜圖，以及對相同的樣品只使用QuEChERS方法而未使用Oasis MCX小柱凈化的UPLC/MS/MS圖譜。結(jié)果吻合度良好，LC/UV檢測到11ppb的多菌靈，UPLC/MS/MS檢測到13ppb的多菌靈。在受檢的橙汁樣品中未鑒別出其他殺菌劑。圖4是已測樣品的UV圖譜與ppb標準品得到的參比圖譜的對比，證實了橙汁樣品中殘留物的存在。

　　結(jié)論

　　DisQuE試劑袋(QuEChERS)能夠有效地從橙汁中萃取康唑類殺菌劑;該方法可提供高通量和低檢測限的分析，分析過程快速、簡單、穩(wěn)定、安全;QuEChERS提取液可直接用于UPLC/MS/MS分析，而不用進一步凈化;簡潔的Oasis MCX固相萃取流程為低ppb檢測限的多菌靈UV檢測提供了有效的樣品凈化和富集方法;Oasis MCX固相萃取凈化能夠增強UPLC/MS/MS的分析性能，即使這一步驟并非必需過程;經(jīng)固相萃取凈化后的橙汁樣品中的多菌靈，其LC/UV與UPLC/MS/MS分析結(jié)果達到一致。