?食品中硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)技術(shù)研究
2016-08-12 14:35:31 來(lái)源: 食品安全導(dǎo)刊
評(píng)論0條 我來(lái)說(shuō)兩句
國(guó)內(nèi)外都對(duì)呋喃類(lèi)物質(zhì)采取了嚴(yán)格的控制手段,對(duì)其測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)都有明確規(guī)定。2003年歐盟(EU)通過(guò)了2003/181/EC委員會(huì)決議,規(guī)定用于禽肉產(chǎn)品和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的最小要求性能限值(Minimum Required Performance Limits,MRPL)為1μg/L。2002年,我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第235號(hào)公告中說(shuō)明在動(dòng)物性食品中不得檢出稍基呋喃類(lèi)藥物,并在飼養(yǎng)過(guò)程中禁止使用此藥物。2010年,衛(wèi)生部將硝基呋喃類(lèi)藥物列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單》。
目前,硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜一質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等儀器方法及免疫檢測(cè)法(Immunoassay,IA)。隨著我國(guó)對(duì)食品安全日益重視,檢測(cè)樣品量與日俱增,儀器分析方法因過(guò)程復(fù)雜,耗時(shí)長(zhǎng)而無(wú)法滿足大批量、快速、及時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。因此,開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)方法已成為保障食品安全的關(guān)鍵。
酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay, ELISA)已成為近年來(lái)發(fā)展較快的免疫分析技術(shù)。其基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)原理,可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析,特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單,正逐步應(yīng)用于多種藥物的殘留檢測(cè),成為當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項(xiàng)微量測(cè)定技術(shù)。本文主要分析酶聯(lián)免疫分析法在呋喃類(lèi)藥物殘留中的應(yīng)用。
材料與方法
實(shí)驗(yàn)材料包括雞肉、魚(yú)肉,樣本均為市售產(chǎn)品;試劑包括乙酸乙酯(分析純)、正己烷(分析純)、硫酸鋅、磷酸氫二鉀等試劑(上海華美公司)。儀器包括酶標(biāo)儀(美國(guó)Thermo公司)、分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器公司)、均質(zhì)器(莆田市南榮貿(mào)易有限公司)、溫箱(天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司)、氮吹儀(美國(guó)Organomation公司)、離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)、微量移液器(美國(guó)Thermo公司)等。
樣品前處理過(guò)程:取1g均質(zhì)的樣品于50mL離心管中,依次加入4mL去離子水、0.5mL 1M HCl和80μL 50mM鄰硝基苯甲醛,渦動(dòng)1min至組織充分分散。衍生化16h(37℃溫箱孵育16h)后,依次加入5mL緩沖溶液、400μL 1M NaOH和6mL乙酸乙酯,劇烈渦動(dòng)1min、4000g以上離心10min。取3mL上清液于新的離心管中,50~60℃水浴中,氮?dú)獯蹈?,加?mL正己烷,再加入1mL樣品稀釋液,高速渦動(dòng)30s,離心5min,吸取下層清液500μL于干凈離心管中,并取50μL進(jìn)行檢測(cè)。
ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線建立:取6個(gè)濃度(0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81μg/L)呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品,用每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值(B)除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液(0標(biāo)準(zhǔn))的吸光度值(B0)再乘以100%,得到百分吸光度值。對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析,以標(biāo)準(zhǔn)品濃度(μg/L)的自然對(duì)數(shù)值為X軸,百分吸光度值為Y軸擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線,計(jì)算半抑制濃度(IC50)。
樣本測(cè)定檢測(cè)操作步驟:將50μL各標(biāo)準(zhǔn)品工作液和樣品溶液分別加入對(duì)應(yīng)的樣品孔中,依次加入50μL酶標(biāo)記物工作液、50μL的抗體工作液;蓋好蓋板膜,輕輕振蕩酶標(biāo)板10s,充分混勻,室溫下避光反應(yīng)30min。倒掉板孔中液體,加入260μL洗滌工作液,充分洗滌,加入底物混合液。避光反應(yīng)后,加入50μL終止液,輕輕振蕩、混勻。用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630nm下檢測(cè)吸光度。
對(duì)性能的分析:為了證明酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)性能,對(duì)試劑盒的靈敏度、最低檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、精密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。同時(shí),為了證明所用試劑盒的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性,分別對(duì)10份雞肉和魚(yú)肉盲樣進(jìn)行測(cè)定,與儀器分析方法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。儀器方法采用GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法》中所述的檢測(cè)方法進(jìn)行操作。
結(jié)果分析
標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立:
以呋喃唑酮代謝物為例,利用維德維康數(shù)據(jù)分析軟件建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1),標(biāo)準(zhǔn)曲線信息見(jiàn)表1,IC50=0.035μg/L,相關(guān)系數(shù)r=0.9978,線性范圍為:0~0.810μg/L,結(jié)果表明呋喃唑酮代謝物在0.01~0.810μg/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性。
準(zhǔn)確度和精密度的確定:準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真實(shí)值的符合程度,在ELISA測(cè)定中,準(zhǔn)確度常以回收率表示,精密度常以變異系數(shù)來(lái)表示。在本實(shí)驗(yàn)中,取空白樣品,將雞肉、魚(yú)肉依次按1倍檢測(cè)限和2倍檢測(cè)限濃度呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加,每個(gè)添加5個(gè)平行。用3個(gè)批次的試劑盒測(cè)定,計(jì)算添加回收率及板內(nèi)板間變異系數(shù),結(jié)果見(jiàn)表4~表5。經(jīng)計(jì)算得,雞肉樣品各添加濃度的回收率在87%~99.5%之間;魚(yú)肉樣品各添加濃度的回收率均在88%~100%之間。呋喃唑酮代謝物在所有樣品中各添加濃度的板內(nèi)變異系數(shù)均低于5%,板間變異系數(shù)均低于10%。
與儀器方法比較:用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和儀器法分別對(duì)10份雞肉、魚(yú)肉盲樣進(jìn)行測(cè)定,比較測(cè)定結(jié)果,以儀器方法檢測(cè)限作為陰陽(yáng)性判定值,小于儀器檢測(cè)限試劑盒檢測(cè)結(jié)果記為“-”,儀器結(jié)果記為“ND”,大于儀器檢測(cè)限以實(shí)際檢測(cè)值表示。結(jié)果見(jiàn)表6~表7。結(jié)果顯示,二者的符合率為100%。
討論
本文以雞肉和魚(yú)肉的呋喃唑酮代謝物檢測(cè)為例,分析了ELISA法在肉及肉制品中硝基呋喃類(lèi)藥物快速檢測(cè)的可行性。結(jié)果表明,維德維康生物技術(shù)有限公司研制的呋喃唑酮代謝物酶聯(lián)免疫試劑盒具有較低的檢測(cè)限、較高的靈敏度和準(zhǔn)確度,并且與儀器分析方法結(jié)果一致,說(shuō)明ELISA試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的準(zhǔn)確檢測(cè)。同時(shí),ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單,有效地縮減了檢測(cè)時(shí)間,提高檢測(cè)效率的同時(shí)降低了檢測(cè)成本。
雖然具有潛在“三致”作用的硝基呋喃類(lèi)抗菌素在國(guó)內(nèi)外已禁用了二十余年,但時(shí)至今日硝基呋喃類(lèi)抗菌素及其代謝物 殘留仍時(shí)有檢出。因此,開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)方法已成為保障食品安全的關(guān)鍵,而ELISA試劑盒的強(qiáng)特異性、及時(shí)性、低成本能夠有效地填補(bǔ)硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)的空白,有力地推動(dòng)我國(guó)食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。
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