硝基呋喃類(lèi)藥物是一類(lèi)人工合成的抗生素,主要包括呋喃唑酮(furazolidone)、呋喃它酮(furaltadone)、呋喃西林(furacillin)和呋喃妥因(nitrofurantion)等，是治療畜禽胃腸道疾病的藥物或作為飼料添加劑，廣泛應(yīng)用于臨床和動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)。動(dòng)物大劑量或長(zhǎng)期使用硝基呋喃類(lèi)藥物會(huì)引起中毒性反應(yīng)，出現(xiàn)厭食、腹瀉、胃腸出血、周?chē)窠?jīng)炎等癥狀，甚至引發(fā)死亡。當(dāng)硝基呋喃類(lèi)藥物及其代謝產(chǎn)物通過(guò)動(dòng)物性食品被人體吸收后，能在體內(nèi)蓄積，導(dǎo)致慢性中毒，甚至致癌、致畸、致突變。由于硝基呋喃類(lèi)抗生素的代謝物在動(dòng)物組織中殘留時(shí)間較久且不易降解，所以對(duì)硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)一般通過(guò)檢測(cè)其代謝物來(lái)實(shí)現(xiàn)。
    國(guó)內(nèi)外都對(duì)呋喃類(lèi)物質(zhì)采取了嚴(yán)格的控制手段，對(duì)其測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)都有明確規(guī)定。2003年歐盟(EU)通過(guò)了2003/181/EC委員會(huì)決議，規(guī)定用于禽肉產(chǎn)品和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)藥物代謝物的最小要求性能限值(Minimum Required Performance Limits，MRPL)為1μg/L。2002年，我國(guó)農(nóng)業(yè)部發(fā)布的第235號(hào)公告中說(shuō)明在動(dòng)物性食品中不得檢出稍基呋喃類(lèi)藥物，并在飼養(yǎng)過(guò)程中禁止使用此藥物。2010年，衛(wèi)生部將硝基呋喃類(lèi)藥物列入《食品中可能違法添加的非食用物質(zhì)名單》。
    目前，硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)方法主要有高效液相色譜(HPLC)、液相色譜一質(zhì)譜法(LC-MS)、液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法(LC-MS/MS)等儀器方法及免疫檢測(cè)法(Immunoassay，IA)。隨著我國(guó)對(duì)食品安全日益重視，檢測(cè)樣品量與日俱增，儀器分析方法因過(guò)程復(fù)雜，耗時(shí)長(zhǎng)而無(wú)法滿足大批量、快速、及時(shí)、現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的需要。因此，開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)方法已成為保障食品安全的關(guān)鍵。
    酶聯(lián)免疫分析法(Enzyme Linked Immuno-sorbent Assay, ELISA)已成為近年來(lái)發(fā)展較快的免疫分析技術(shù)。其基于抗原抗體反應(yīng)和酶化學(xué)反應(yīng)原理，可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析，特異性強(qiáng)、靈敏度高、重復(fù)性好、操作簡(jiǎn)單，正逐步應(yīng)用于多種藥物的殘留檢測(cè)，成為當(dāng)前應(yīng)用最廣、發(fā)展最快的一項(xiàng)微量測(cè)定技術(shù)。本文主要分析酶聯(lián)免疫分析法在呋喃類(lèi)藥物殘留中的應(yīng)用。
    材料與方法
    實(shí)驗(yàn)材料包括雞肉、魚(yú)肉，樣本均為市售產(chǎn)品；試劑包括乙酸乙酯（分析純）、正己烷（分析純）、硫酸鋅、磷酸氫二鉀等試劑（上海華美公司）。儀器包括酶標(biāo)儀（美國(guó)Thermo公司）、分析天平（賽多利斯科學(xué)儀器公司）、均質(zhì)器（莆田市南榮貿(mào)易有限公司）、溫箱（天津市中環(huán)實(shí)驗(yàn)電爐有限公司）、氮吹儀（美國(guó)Organomation公司）、離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）、微量移液器（美國(guó)Thermo公司）等。
    樣品前處理過(guò)程：取1g均質(zhì)的樣品于50mL離心管中，依次加入4mL去離子水、0.5mL 1M HCl和80μL 50mM鄰硝基苯甲醛，渦動(dòng)1min至組織充分分散。衍生化16h（37℃溫箱孵育16h）后，依次加入5mL緩沖溶液、400μL 1M NaOH和6mL乙酸乙酯，劇烈渦動(dòng)1min、4000g以上離心10min。取3mL上清液于新的離心管中，50~60℃水浴中，氮?dú)獯蹈?，加?mL正己烷，再加入1mL樣品稀釋液，高速渦動(dòng)30s，離心5min，吸取下層清液500μL于干凈離心管中，并取50μL進(jìn)行檢測(cè)。
    ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線建立：取6個(gè)濃度（0、0.01、0.03、0.09、0.27、0.81μg/L）呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品，用每個(gè)濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度平均值（B）除以第一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品溶液（0標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值（B0）再乘以100％，得到百分吸光度值。對(duì)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)行分析，以標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/L）的自然對(duì)數(shù)值為X軸，百分吸光度值為Y軸擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算半抑制濃度（IC50）。
    樣本測(cè)定檢測(cè)操作步驟：將50μL各標(biāo)準(zhǔn)品工作液和樣品溶液分別加入對(duì)應(yīng)的樣品孔中，依次加入50μL酶標(biāo)記物工作液、50μL的抗體工作液；蓋好蓋板膜，輕輕振蕩酶標(biāo)板10s，充分混勻，室溫下避光反應(yīng)30min。倒掉板孔中液體，加入260μL洗滌工作液，充分洗滌，加入底物混合液。避光反應(yīng)后，加入50μL終止液，輕輕振蕩、混勻。用酶標(biāo)儀在雙波長(zhǎng)450nm、630nm下檢測(cè)吸光度。
    對(duì)性能的分析：為了證明酶聯(lián)免疫試劑盒對(duì)呋喃類(lèi)藥物殘留的檢測(cè)性能，對(duì)試劑盒的靈敏度、最低檢測(cè)限、準(zhǔn)確度、精密度進(jìn)行統(tǒng)計(jì)計(jì)算。同時(shí)，為了證明所用試劑盒的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確性，分別對(duì)10份雞肉和魚(yú)肉盲樣進(jìn)行測(cè)定，與儀器分析方法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比。儀器方法采用GB/T 20752-2006《豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品中硝基呋喃類(lèi)代謝物殘留量的測(cè)定液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法》中所述的檢測(cè)方法進(jìn)行操作。
    結(jié)果分析
    標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立：
    以呋喃唑酮代謝物為例，利用維德維康數(shù)據(jù)分析軟件建立ELISA標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1），標(biāo)準(zhǔn)曲線信息見(jiàn)表1，IC50=0.035μg/L，相關(guān)系數(shù)r=0.9978，線性范圍為：0~0.810μg/L，結(jié)果表明呋喃唑酮代謝物在0.01~0.810μg/L的濃度范圍內(nèi)有良好的線性。     最低檢測(cè)限的確定：樣品的最低檢測(cè)限是靈敏度的一個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)。在本實(shí)驗(yàn)中，分別測(cè)定了20個(gè)空白雞肉、魚(yú)肉等樣品，根據(jù)樣本檢測(cè)線（LOD）=20份空白樣本（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）+3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差（SD），可以確定各樣本的檢測(cè)限，結(jié)果由表2~表6所示。結(jié)果表明，本試劑盒雞肉檢測(cè)限為0.098μg/L，魚(yú)肉檢測(cè)限為0.095μg/L。




    準(zhǔn)確度和精密度的確定：準(zhǔn)確度是指測(cè)定值與真實(shí)值的符合程度，在ELISA測(cè)定中，準(zhǔn)確度常以回收率表示，精密度常以變異系數(shù)來(lái)表示。在本實(shí)驗(yàn)中，取空白樣品，將雞肉、魚(yú)肉依次按1倍檢測(cè)限和2倍檢測(cè)限濃度呋喃唑酮代謝物標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行添加，每個(gè)添加5個(gè)平行。用3個(gè)批次的試劑盒測(cè)定，計(jì)算添加回收率及板內(nèi)板間變異系數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表4~表5。經(jīng)計(jì)算得，雞肉樣品各添加濃度的回收率在87%~99.5%之間；魚(yú)肉樣品各添加濃度的回收率均在88%~100%之間。呋喃唑酮代謝物在所有樣品中各添加濃度的板內(nèi)變異系數(shù)均低于5%，板間變異系數(shù)均低于10%。
    與儀器方法比較：用酶聯(lián)免疫檢測(cè)法和儀器法分別對(duì)10份雞肉、魚(yú)肉盲樣進(jìn)行測(cè)定，比較測(cè)定結(jié)果，以儀器方法檢測(cè)限作為陰陽(yáng)性判定值，小于儀器檢測(cè)限試劑盒檢測(cè)結(jié)果記為“－”，儀器結(jié)果記為“ND”，大于儀器檢測(cè)限以實(shí)際檢測(cè)值表示。結(jié)果見(jiàn)表6~表7。結(jié)果顯示，二者的符合率為100%。


    討論
    本文以雞肉和魚(yú)肉的呋喃唑酮代謝物檢測(cè)為例，分析了ELISA法在肉及肉制品中硝基呋喃類(lèi)藥物快速檢測(cè)的可行性。結(jié)果表明，維德維康生物技術(shù)有限公司研制的呋喃唑酮代謝物酶聯(lián)免疫試劑盒具有較低的檢測(cè)限、較高的靈敏度和準(zhǔn)確度，并且與儀器分析方法結(jié)果一致，說(shuō)明ELISA試劑盒能夠?qū)崿F(xiàn)硝基呋喃類(lèi)藥物殘留的準(zhǔn)確檢測(cè)。同時(shí)，ELISA試劑盒實(shí)驗(yàn)操作簡(jiǎn)單，有效地縮減了檢測(cè)時(shí)間，提高檢測(cè)效率的同時(shí)降低了檢測(cè)成本。
    雖然具有潛在“三致”作用的硝基呋喃類(lèi)抗菌素在國(guó)內(nèi)外已禁用了二十余年，但時(shí)至今日硝基呋喃類(lèi)抗菌素及其代謝物 殘留仍時(shí)有檢出。因此，開(kāi)發(fā)出簡(jiǎn)潔、快速、高靈敏、大批量、低成本的硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)方法已成為保障食品安全的關(guān)鍵，而ELISA試劑盒的強(qiáng)特異性、及時(shí)性、低成本能夠有效地填補(bǔ)硝基呋喃類(lèi)藥物殘留快速檢測(cè)的空白，有力地推動(dòng)我國(guó)食品安全快速檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展。