摘　要：以脫毒蘋(píng)果和未脫毒蘋(píng)果為原料，采用HS-SPME技術(shù)萃取蘋(píng)果中的香氣成分，GC-MS技術(shù)測(cè)定蘋(píng)果中的香氣成分，通過(guò)比較脫毒蘋(píng)果與未脫毒蘋(píng)果香氣成分的含量和種類的差異，找出脫毒蘋(píng)果的特征香氣，得出病毒侵染對(duì)蘋(píng)果香氣成分的影響。經(jīng)研究，脫毒蘋(píng)果香氣成分主要有酯類、醇類、酸類、醛類、酰胺類、烯類和其他類化合物，未脫毒蘋(píng)果的香氣成分主要是酸類、酯類和醇類和烯類和其他類化合物。脫毒蘋(píng)果特有的香氣成分為：丙酸芳樟酯、乙酸異戊酯、苯甲酸乙酯、癸酸乙酯、1,2－苯二甲酸二酯、月桂酸乙酯、己酸乙酯、月桂醇、正己醇、十一醇、丁二醇、2－甲基－2－丁醇、6－甲基－3－庚醇、4－甲基甘露醇、雪松醇、3－酞酰亞氨甲基苯甲酸、碳酸等。病毒侵染使得蘋(píng)果的香氣物質(zhì)種類減少，含量下降。
    關(guān)鍵詞：脫毒蘋(píng)果　未脫毒蘋(píng)果　香氣成分
    1 蘋(píng)果的經(jīng)濟(jì)價(jià)值及社會(huì)地位
    蘋(píng)果為薔薇科落葉喬木，是世界上種植面積最廣的一種果樹(shù)，我國(guó)蘋(píng)果的種植面積和產(chǎn)量都居世界第一。蘋(píng)果果實(shí)含有大量的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，如糖分、膳食纖維、鈣、鐵、維生素C、維生素B₁、維生素B₂等30多種人體所需物質(zhì)^[1]。
    2 蘋(píng)果病毒概述及目前的預(yù)防研究
    蘋(píng)果病毒在我國(guó)廣泛發(fā)生，已成為限制我國(guó)蘋(píng)果優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)的關(guān)鍵因素^[1]。目前已在我國(guó)發(fā)現(xiàn)并鑒定的蘋(píng)果病毒有：蘋(píng)果花葉病毒(Apple mosaic virus,ApMV)、蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus,ACLSV)、蘋(píng)果凹果類病毒(Apple dimple fruit viroid,ADFVd)^[2]，蘋(píng)果一旦感染上病毒就很難治愈。由于蘋(píng)果病毒是通過(guò)嫁接傳染，無(wú)傳毒介體，所以栽培無(wú)毒苗木是防治的主要途徑^[3]，蘋(píng)果病毒的危害日益受到栽培者的重視^[4]。針對(duì)這種情況，近年來(lái)，宋來(lái)慶、李元軍、趙玲玲等人^[5]采用熱處理的方法培育出脫毒“煙富3號(hào)”蘋(píng)果苗木，成為近年來(lái)最暢銷的蘋(píng)果苗木之一。但大眾無(wú)法區(qū)分脫毒蘋(píng)果與非脫毒蘋(píng)果，容易造成兩種蘋(píng)果的混淆。目前，科學(xué)工作者通過(guò)對(duì)其多項(xiàng)指標(biāo)進(jìn)行檢測(cè)來(lái)區(qū)分，但操作復(fù)雜，涉及的步驟較多，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)龐大，處理數(shù)據(jù)消耗時(shí)間較長(zhǎng)，不僅浪費(fèi)資金，而且緩慢的檢測(cè)速度不能滿足廣大市場(chǎng)對(duì)蘋(píng)果的需求。
    3 蘋(píng)果香氣成分探究的目的及意義
    果實(shí)香氣是反映果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，研究蘋(píng)果香氣物質(zhì)對(duì)提高蘋(píng)果品質(zhì)、進(jìn)行優(yōu)選育種及其深加工具有重要意義。果實(shí)香氣源于某些揮發(fā)性物質(zhì)，目前，蘋(píng)果香氣中已鑒定出350多種成分，但只有含量超過(guò)其味感閾值的物質(zhì)成分才會(huì)對(duì)果實(shí)風(fēng)味的形成起重要作用，同一個(gè)果實(shí)的不同部位，致香物質(zhì)的含量也有差異^[6]。本次探究主要針對(duì)病毒對(duì)蘋(píng)果果實(shí)及其葉子揮發(fā)性成分的影響，通過(guò)比較脫毒蘋(píng)果與非脫毒蘋(píng)果香氣成分種類和含量的差別，找出脫毒蘋(píng)果具有的特征香氣成分，將其轉(zhuǎn)化為一項(xiàng)或簡(jiǎn)單的幾項(xiàng)指標(biāo)，通過(guò)該特征香氣來(lái)判斷樣品蘋(píng)果是“脫毒蘋(píng)果”還是非脫毒蘋(píng)果，為蘋(píng)果的病毒檢測(cè)提供一種新手段。
    4 研究方法
    4.1 頂空固相微萃取（HS-SPME）
    頂空固相微萃取是一種無(wú)溶劑萃取技術(shù)，它集采樣、萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體，具有簡(jiǎn)單、快速、高效、無(wú)污染、便攜、靈敏度高^[7]、易于與其他儀器聯(lián)用等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于揮發(fā)性成分分析^[8]。該方法優(yōu)化了分析條件，建立了快速測(cè)定香氣物質(zhì)的方法，在常見(jiàn)香氣物質(zhì)的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，對(duì)常見(jiàn)香氣物質(zhì)的定量比較準(zhǔn)確^[9]。可快速檢測(cè)出蘋(píng)果所含的幾百種香氣成分，具有高效、便捷、快速、準(zhǔn)確的特點(diǎn)。
    4.2 氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(GC-MS)
    色譜法一般是由固定相和流動(dòng)相組成。氣相色譜法的流動(dòng)相是氣體，因此要求樣品應(yīng)在色譜柱內(nèi)轉(zhuǎn)化成氣體。根據(jù)分配系數(shù)的差異，使樣品在固定相與氣相之間分離。通過(guò)峰的形狀、大小對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定性分析，通過(guò)保留時(shí)間、峰面積、內(nèi)標(biāo)物的峰面積及濃度來(lái)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析。質(zhì)譜法是利用電磁學(xué)、質(zhì)核比(m/z)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行分離分析的一種方式。采用SPME與GC-MS結(jié)合，對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行鑒定分析，并優(yōu)化了SPME條件，為進(jìn)一步研究揮發(fā)性物質(zhì)的種類和含量提供理論和數(shù)據(jù)支持^[10]。此方法可以快速處理大量實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，找出脫毒蘋(píng)果和非脫毒蘋(píng)果的香氣成分區(qū)別。
    5 實(shí)驗(yàn)儀器及試劑
    5.1 實(shí)驗(yàn)儀器
    GC-MS-2010q氣質(zhì)聯(lián)用儀：日本島津公司；SPME纖維萃取頭CAR/DVB/PDMS（50μm/30μm）：美國(guó)Supelco公司；SPME手動(dòng)進(jìn)樣手柄：美國(guó)Supelco公司；DB-Wax色譜柱（30m×0.25mm×0.25μm）：美國(guó)Agilent公司；DF-101Z集熱式恒溫加熱磁力攪拌器：河南省予華儀器有限公司；分析天平：福州華志科學(xué)儀器有限公司；微量進(jìn)樣器（10μL）：上海市安亭微量進(jìn)樣器廠；移液管：5mL、10mL。
    5.2 實(shí)驗(yàn)樣品和試劑
    喬納金蘋(píng)果葉、嘎啦蘋(píng)果葉：煙臺(tái)市棲霞蘋(píng)果園采摘；脫毒蘋(píng)果葉：煙臺(tái)農(nóng)科院提供；NaCl（分析純）：上海國(guó)藥集團(tuán)；3-辛醇（色譜純）：美國(guó)Sigma-Aldrich公司。
    6 實(shí)驗(yàn)方法
    6.1 樣品預(yù)處理
    將已采集的嘎啦、喬納金及脫毒蘋(píng)果的蘋(píng)果葉進(jìn)行剪碎，并放入研缽中研碎。利用分析天平稱量，每組等分后做2份樣品（約0.5g/份），將已分好的樣品放入保鮮膜中密封保存，并貼好標(biāo)簽備用，依次為1~6號(hào)。
    6.2 萃取條件的設(shè)定
    在之前實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上對(duì)萃取的條件進(jìn)行設(shè)定^[11]。
    萃取時(shí)間5min，萃取溫度50℃，預(yù)平衡時(shí)間5min，解析時(shí)間5min。
    6.3 GC-MS條件的設(shè)定
    在之前實(shí)驗(yàn)的研究基礎(chǔ)上對(duì)氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀的參數(shù)進(jìn)行設(shè)定^[12]。
    GC條件：色譜柱為DB-Wax（30m×0.25mm× 0.25μm）；進(jìn)樣口溫度：230℃；檢測(cè)器溫度230℃；載氣：He；流速：3mL/min；分流比為50.0。
    升溫程序：初始溫度（起始柱溫）40℃，保持2min，后以6℃/min的速度升溫至100℃，再以5℃/min的速度升溫至200℃，最后再以10℃/min的速度升到230℃，保持5min。
    MS條件：EI電離源；電子能量70eV；離子源溫度200℃；接口溫度230℃；掃描范圍m/z 30~500。
    6.4 實(shí)驗(yàn)步驟
    ①將已預(yù)處理好的樣品1號(hào)喬納金蘋(píng)果葉加入到15mL棕色萃取瓶（內(nèi)含轉(zhuǎn)子）中，利用5mL移液管取4mL氯化鈉飽和溶液加入，再利用10μL的微量進(jìn)樣器取3-辛醇加入（3-辛醇濃度為101mg/L）。
    ②將15mL棕色萃取瓶放入恒溫加熱磁力攪拌器中，設(shè)定萃取溫度50℃，預(yù)平衡時(shí)間5min并采用秒表計(jì)時(shí)，然后先將涂有PDMS涂層的纖維萃取頭調(diào)到2cm刻度處，插入到萃取瓶后再將黑柄推下進(jìn)行萃取，注意針頭不要接觸液面，采用秒表計(jì)時(shí)5min。
    ③萃取完畢后，先將黑柄往上提再將纖維萃取頭拔出，并調(diào)至2.6cm刻度處，待氣質(zhì)聯(lián)用儀的電腦顯示綠色Ready，則進(jìn)針于GC-MS中，再按start鍵開(kāi)始測(cè)定，解析時(shí)間5min后將針提出，運(yùn)行時(shí)間40min。
    ④樣品2~6號(hào)重復(fù)上述步驟進(jìn)行測(cè)定。
    ⑤將各個(gè)樣品的總離子流色譜圖和揮發(fā)性成分種類圖的數(shù)據(jù)進(jìn)行完善并保存。
    6.5 揮發(fā)性成分的定量計(jì)算方法
    采用內(nèi)標(biāo)物（本實(shí)驗(yàn)為3-辛醇）計(jì)算出各個(gè)揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量，計(jì)算公式為：
    7 結(jié)果與討論
    脫毒葉子與不脫毒葉子最大的揮發(fā)性成分差異為：醛類物質(zhì)所占的比重遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)普通葉子為20%以上，而普通葉子醛類的比重均在10%以下，這可能與通過(guò)一定手段對(duì)蘋(píng)果樹(shù)脫毒有關(guān)；脫毒葉子酯類、醇類和醛類所占比重均在20%左右，為揮發(fā)性成分的主要種類；酸類物質(zhì)所占的比重較普通葉子略高；肼類物質(zhì)略有下降，低于普通葉子；脫毒葉子出現(xiàn)苯類物質(zhì)，占2%左右。對(duì)于喬納金、嘎啦及脫毒蘋(píng)果葉這3種品種中所檢測(cè)出來(lái)的揮發(fā)性成分的主要物質(zhì)來(lái)看，有約10種物質(zhì)在脫毒葉子中未檢測(cè)到。     8 結(jié)論
    對(duì)于喬納金、嘎啦及脫毒蘋(píng)果葉這3種樣品，經(jīng)HS-SPME萃取后再經(jīng)GC-MS方法分析確定了其主要揮發(fā)性成分，并采用峰面積歸一化法比較脫毒與不脫毒葉子之間的差異，對(duì)于監(jiān)控蘋(píng)果的健康狀況、提高或改善蘋(píng)果的品相品質(zhì)具有重要意義。
    從各種類的香氣成分所占比重來(lái)分析，脫毒葉子中醛類物質(zhì)所占的比重遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)普通葉子為20%以上，而普通葉子醛類的比重均在10%以下；脫毒葉子揮發(fā)性成分主要種類為酯類、醇類和醛類，所占比重均在20%左右；酸類物質(zhì)所占的比重較普通葉子略高；肼類物質(zhì)略有下降，低于普通葉子；脫毒葉子出現(xiàn)苯類物質(zhì)，占2%左右。
    從具體的揮發(fā)性物質(zhì)來(lái)分析，喬納金與嘎啦蘋(píng)果葉中所共有的十種成分在脫毒蘋(píng)果葉中未檢出，為6-甲基3-庚醇、3-辛烯-1-醇、氨基草酰肼、1,1-二甲基乙基肼、5-甲基-2-（1-甲基乙基）反式環(huán)己酮、五氟酸庚酯、乙醇醛二聚體、2-辛醇、5-甲基-2-（1-甲基乙基）-環(huán)己醇。
    通過(guò)結(jié)合以上兩種手段，可以建立一種檢測(cè)果樹(shù)是否感染病毒的方法和理論體系，對(duì)于檢測(cè)果樹(shù)的健康成長(zhǎng)以及指導(dǎo)農(nóng)業(yè)生產(chǎn)具有積極的作用。
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