□ 萬(wàn)宇平 崔海峰 王兆芹 宋灝 叢倩千 北京勤邦生物技術(shù)有限公司、北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程中心

摘　要：本試驗(yàn)建立了一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù)，并在動(dòng)物源性食品中對(duì)其檢測(cè)性能進(jìn)行了研究。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對(duì)豬肉、雞肉等動(dòng)物組織樣品中四環(huán)素類藥物的檢測(cè)限為：四環(huán)素30μg/kg、金霉素60μg/kg、土霉素40μg/kg、強(qiáng)力霉素80μg/kg;對(duì)100ppb的磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、氯霉素等藥物無(wú)交叉反應(yīng)，特異性較好;變異系數(shù)小于6%，精密度高;試紙條對(duì)高、低溫不敏感，穩(wěn)定性強(qiáng)。

關(guān)鍵詞：四環(huán)素類藥物 時(shí)間分辨熒光免疫層析技術(shù) 快速檢測(cè)

四環(huán)素類藥物(TCs)主要由放線菌屬產(chǎn)生，是氫化駢四苯環(huán)衍生物，具有廣譜高效的殺菌抗生功效，對(duì)大部分的革蘭氏陰性和陽(yáng)性菌及少數(shù)酵母有抑制效果，可與大多數(shù)藥物或飼料添加劑混用，現(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于畜禽養(yǎng)殖生產(chǎn)中[1]。但是，四環(huán)素類藥物在使用過(guò)程中存在著長(zhǎng)期濫用的情況，殘留在動(dòng)物源性食品中的四環(huán)素類藥物經(jīng)過(guò)人們的飲食轉(zhuǎn)移到人體內(nèi)，其在體內(nèi)的消化分解物會(huì)抑制蛋白質(zhì)的合成而導(dǎo)致含氮代謝物增加，從而加大腎臟的工作負(fù)擔(dān)，容易引起腎小管壞死，甚至?xí)蚰I功能衰竭而死亡[2]。同時(shí)，四環(huán)素類藥物在人體內(nèi)的累積容易引起惡心、嘔吐、食道潰瘍[3]、骨生長(zhǎng)暫時(shí)性抑制及過(guò)敏反應(yīng)，肝功能障礙者甚至?xí)霈F(xiàn)休克、尿毒癥[4]等癥狀，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康，為此世界各國(guó)對(duì)TCs殘留的檢測(cè)十分關(guān)注。我國(guó)規(guī)定，牛奶中土霉素、四環(huán)素、金霉素殘留限量為100μg/L;歐盟第675/92號(hào)令中初步規(guī)定，在雞肉及牛奶中的四環(huán)素類藥物含量不得超過(guò)100μg/kg，在腎臟、肝臟及雞蛋中的含量分別不得超過(guò)600μg/kg、300μg/kg、200μg/kg;日本《肯定列表制度》規(guī)定，奶和雞蛋中四環(huán)素類化合物的總量分別不得超過(guò)100ng/mL和400ng/mg[5]。

現(xiàn)階段，國(guó)內(nèi)外主要利用高效液相色譜法、毛細(xì)管電泳法、微生物法、酶聯(lián)免疫法、電化學(xué)分析等對(duì)四環(huán)素類藥物進(jìn)行定性和定量檢測(cè)[6-13]。上述各種方法曾在不同時(shí)期得到廣泛應(yīng)用，也各自存在著不同于其他方法的優(yōu)勢(shì)與劣勢(shì)。具體而言，色譜法需要價(jià)格昂貴的大型儀器設(shè)備，步驟繁瑣、耗時(shí)且對(duì)操作人員的專業(yè)性要求較高，不適用于基層企事業(yè)單位的大通量快速篩查檢測(cè);酶聯(lián)免疫試劑盒或膠體金快速檢測(cè)試紙條具有檢測(cè)速度快、價(jià)格便宜、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但其準(zhǔn)確性和重復(fù)性較差，基質(zhì)效應(yīng)明顯，無(wú)法實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，且顏色單一，背景干擾大，容易造成假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果。因此，亟需開(kāi)發(fā)一種簡(jiǎn)單快速、準(zhǔn)確度高的檢測(cè)方法——時(shí)間分辨熒光免疫層析檢測(cè)方法恰好可以滿足此類需求。本實(shí)驗(yàn)研發(fā)了一種檢測(cè)四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條，并在食源性動(dòng)物食品的檢測(cè)中進(jìn)行了應(yīng)用。

1 實(shí)驗(yàn)材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)耗材

PVC板，購(gòu)于上海金標(biāo)生物科技有限公司;時(shí)間分辨熒光微球，購(gòu)于蘇州為度生物技術(shù)有限公司;吸水墊、硝酸纖維素膜、樣品墊，購(gòu)于普利來(lái)基因技術(shù)公司;四環(huán)素類藥物殘留膠體金檢測(cè)試紙條，北京勤邦生物技術(shù)有限公司自制。

1.1.2 試劑

四環(huán)素類藥物、各種交叉反應(yīng)藥物、牛血清白蛋白、卵清蛋白，購(gòu)自Sigma公司;分泌四環(huán)素類藥物單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，北京勤邦生物技術(shù)有限公司制備;其他常規(guī)化學(xué)試劑均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

時(shí)間分辨熒光免疫分析儀和旋渦混勻器，北京勤邦生物技術(shù)有限公司自有;Milli-Q Reference純水儀，購(gòu)自Millipore公司;2000SBL電子天平，購(gòu)自美國(guó)setm公司;冷凍干燥機(jī)，購(gòu)自Imagene公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 熒光微球標(biāo)記四環(huán)素類藥物單克隆抗體的制備

取市售的內(nèi)部包埋熒光染料、表面修飾有羧基官能團(tuán)的微球懸液100μL混懸于900μL、pH5.5~6.5、0.05mol/L的2-(N-嗎啡啉)乙磺酸(MES)活化緩沖液中，于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸微球于1mL活化緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入適量活化劑，混勻后室溫震蕩活化10min。將上述混懸液于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸于pH7.5~8.5、0.05mol/L的硼酸鹽偶聯(lián)緩沖液中，以此法洗滌微球2次，加入10~20μL四環(huán)素類藥物單克隆抗體溶液(蛋白濃度為1mg/mL)，混勻后室溫震蕩偶聯(lián)120min。獲得混懸液于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸于0.1~0.4mol/L伯胺(鹽酸羥胺、乙醇胺或氨基乙醇)、1%~10%BSA且pH7.4的PB封閉緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后室溫震蕩封閉30min，然后于4℃下10000r/min離心10min后棄上清，重懸于0.01%NaN3、0.1%BSA且pH7.4的PB貯存緩沖液中，以此法洗滌微球1次，混勻后于4℃避光保存。

1.3.2 試紙條的制備

①硝酸纖維素(NC)膜的制備

用0.05mol/L、pH7.2的PBS緩沖液將四環(huán)素類藥物半抗原-卵清蛋白偶聯(lián)物稀釋到100μg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其噴涂于NC膜上的檢測(cè)區(qū)(T)，噴膜量為1.0μL/cm。用0.01mol/L、pH7.4的PBS緩沖液將羊抗鼠抗體稀釋到200μg/mL，用Isoflow點(diǎn)膜儀將其噴涂于NC膜上的質(zhì)控區(qū)(C)，噴膜量為1.0μL/cm。將制備好的NC膜置于37℃條件下干燥2h，備用。

②樣品吸收墊的制備

將樣品吸收墊用含0.5%牛血清白蛋白(體積分?jǐn)?shù))、pH7.2、0.1mol/L的磷酸鹽緩沖液浸泡2h，置于37℃下烘干2h，備用。

③試紙條的組裝

將樣品吸收墊、硝酸纖維素膜、吸水墊從左至右依次搭接粘貼固定在底板上，樣品吸收墊的末端與硝酸纖維素膜的始端相連，硝酸纖維素膜的末端與吸水墊的始端相連，樣品吸收墊的始端與底板的始端對(duì)齊，吸水墊的末端與底板的末端對(duì)齊，然后用機(jī)器切成寬3.96mm的小條，裝在特制的塑料制卡中，形成試紙卡。

將試紙卡與微孔試劑組裝成四環(huán)素類藥物時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條，在2~8℃下陰涼避光干燥保存，有效期為12個(gè)月。

1.3.3 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1g±0.01g組織樣品至10mL離心管中，加入3mL樣本提取液，渦動(dòng)2min充分混勻后，3000r/min離心5min后取上清(若上層有漂浮物則撥開(kāi)取上清)待檢。

1.3.4 檢測(cè)過(guò)程

用微量移液器準(zhǔn)確吸取100μL待檢樣品溶液于微孔中，小心抽吸至充分與微孔中試劑混勻，室溫(20~25℃)作用3min;吸取孔內(nèi)混合液全部量(約100μL)垂直滴加于試紙卡加樣孔(S孔)中，液體流動(dòng)時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí)，室溫反應(yīng)5min;用時(shí)間分辨熒光免疫分析儀或紫外光下肉眼判讀結(jié)果。

1.3.5 檢測(cè)結(jié)果分析

陰性(-)：若熒光檢測(cè)儀的顯示屏幕上結(jié)果顯示為陰性，或紫外燈下肉眼觀察T線亮度比C線亮度亮一半以上，則表示樣本中不含有四環(huán)素類藥物或其濃度低于檢測(cè)限。

陽(yáng)性(+)：若熒光檢測(cè)儀的顯示屏幕上結(jié)果顯示為陽(yáng)性，或紫外燈下肉眼觀察T線亮度比C線亮度暗一半以上，則表示樣本中四環(huán)素類藥物濃度等于或高于檢測(cè)限。

無(wú)效：若質(zhì)控區(qū)未檢出熒光信號(hào)強(qiáng)度，表明操作過(guò)程不正確或試紙卡已失效。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗(yàn)

向豬肉組織中分別加入1/2、1、2倍檢測(cè)限濃度的四環(huán)素類藥物，以未加入四環(huán)素類藥物的豬肉組織為空白對(duì)照，每組檢測(cè)10次，結(jié)果如圖1所示。

圖1 試紙條精密度試驗(yàn)檢測(cè)圖

由圖1可明顯看出，同一添加濃度下，平行檢測(cè)樣的檢測(cè)結(jié)果相同，同時(shí)檢測(cè)線亮度保持一致。通過(guò)熒光檢測(cè)儀對(duì)T、C線的亮度進(jìn)行讀數(shù)，計(jì)算試紙條的變異系數(shù)小于6%，說(shuō)明本試驗(yàn)研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)試紙條檢測(cè)性能穩(wěn)定，精密度高。

2.2 檢測(cè)限試驗(yàn)

向空白豬肉、雞肉樣品中分別添加四環(huán)素類藥物標(biāo)準(zhǔn)品至終濃度為：四環(huán)素15、30、45、60μg/kg，金霉素30、60、90、120μg/kg，土霉素20、40、60、80μg/kg，強(qiáng)力霉素40、80、120、160μg/kg，分別以未添加四環(huán)素類藥物的豬肉、雞肉組織為空白對(duì)照，用時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條進(jìn)行檢測(cè)驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果如圖2所示。

圖2 試紙條檢測(cè)限實(shí)驗(yàn)圖

圖2顯示，隨著四環(huán)素類藥物濃度的增加，試紙條檢測(cè)結(jié)果陰性越明顯。當(dāng)豬肉組織和雞肉組織中四環(huán)素類藥物的添加量為1倍，即四環(huán)素為30μg/kg、金霉素為60μg/kg、土霉素為40μg/kg、強(qiáng)力霉素為80μg/kg時(shí)，T線亮度為C線亮度的一半左右，結(jié)合讀數(shù)儀的檢測(cè)結(jié)果可以進(jìn)一步印證，本試驗(yàn)研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)試紙條對(duì)四環(huán)素、金霉素、土霉素和強(qiáng)力霉素的檢測(cè)限分別為30μg/kg、60μg/kg、40μg/kg、80μg/kg。

2.3 特異性試驗(yàn)

分別向豬肉組織中添加30μg/kg四環(huán)素(TC)、100μg/kg磺胺二甲基嘧啶(SM2)、恩諾沙星(ENR)、氯霉素(CAP)，以未添加任何藥物的豬肉組織為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做2次平行試驗(yàn)，檢測(cè)結(jié)果如圖3所示。

圖3 試紙條特異性試驗(yàn)檢測(cè)圖

圖3顯示，當(dāng)向檢測(cè)樣中添加30μg/kg四環(huán)素時(shí)，試紙條檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而添加100μg/kg磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、氯霉素等藥物的檢測(cè)樣品檢測(cè)結(jié)果均為陰性，即本試紙條對(duì)磺胺二甲基嘧啶、恩諾沙星、氯霉素等藥物無(wú)交叉反應(yīng)，特異性好。

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

將試紙條分別置于4℃和37℃下14d與28d，相同情況下檢測(cè)加入30μg/kg四環(huán)素的豬肉組織和雞肉組織樣品中，以未經(jīng)過(guò)處理的試紙條檢測(cè)值為空白對(duì)照，每個(gè)樣品做3次平行試驗(yàn)，分別采用肉眼判斷和讀數(shù)儀對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行測(cè)定，用于檢測(cè)四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析試紙條穩(wěn)定性，結(jié)果如表1所示。

從表1可以看出，本試驗(yàn)研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)試紙條經(jīng)高、低溫處理后對(duì)四環(huán)素類藥物的檢測(cè)靈敏度沒(méi)有發(fā)生顯著變化，表明試紙條穩(wěn)定性較強(qiáng)。

2.5 與其他檢測(cè)方法的對(duì)比

分別用勤邦公司的四環(huán)素類藥物檢測(cè)膠體金試紙條、時(shí)間分辨熒光試紙條和儀器方法測(cè)定添加不同濃度四環(huán)素類藥物的豬肉組織，儀器方法參考GB/T 21317-2007 《動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類獸藥殘留量檢測(cè)方法 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法與高效液相色譜法》(本方法對(duì)四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素檢測(cè)限均為50μg/kg)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

表2的檢測(cè)結(jié)果顯示，膠體金試紙條對(duì)四環(huán)素類藥物的檢測(cè)限最低，時(shí)間分辨熒光試紙條次之，但均高于儀器檢測(cè)法，均符合我國(guó)、歐盟和日本對(duì)四環(huán)素類藥物殘留的相關(guān)規(guī)定。

3 討論

本試驗(yàn)成功開(kāi)發(fā)了一種動(dòng)物源食品中四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)試紙條，采用本試紙條對(duì)不同動(dòng)物源性食品中四環(huán)素類藥物殘留檢測(cè)的精密度、檢測(cè)限、特異性和穩(wěn)定性等性能指標(biāo)進(jìn)行了探討，同時(shí)將本試驗(yàn)研發(fā)的檢測(cè)方法同已有的膠體金和儀器檢測(cè)方法進(jìn)行了比較，結(jié)果顯示，本試驗(yàn)研發(fā)的試紙條檢測(cè)限高于膠體金、低于儀器檢測(cè)法。但是，同膠體金試紙條相比，本試驗(yàn)研發(fā)的四環(huán)素類藥物時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)試紙條制備過(guò)程中需要的原材料少，尤其是對(duì)抗原和抗體的需求量遠(yuǎn)少于膠體金試紙條，制作成本低。此外，由于本試紙條采用熒光微球模式，其染料熒光猝滅大大減少，發(fā)射強(qiáng)而穩(wěn)定，檢測(cè)結(jié)果不受豬肉、雞肉等組織檢測(cè)樣中雜質(zhì)的影響，有效提高了檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和穩(wěn)定性。

綜上，本試驗(yàn)研發(fā)的四環(huán)素類藥物的時(shí)間分辨熒光免疫層析快速檢測(cè)試紙條可用于四環(huán)素類多種藥物的同時(shí)檢測(cè)，其準(zhǔn)確性和可靠性均可滿足我國(guó)、歐盟和日本對(duì)四環(huán)素類藥物的檢測(cè)技術(shù)的要求。同時(shí)，該方法具有檢測(cè)靈敏度高、操作簡(jiǎn)便、穩(wěn)定性好、生成成本低等優(yōu)點(diǎn)，可用于不同動(dòng)物食源性食品中四環(huán)素類藥物的快速檢測(cè)分析，應(yīng)用前景廣闊。

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基金項(xiàng)目：河北省科技計(jì)劃項(xiàng)目資助(16275507D)。