MALDI-TOF MS在食品微生物中的應用：數(shù)分鐘內(nèi)確認和鑒定微生物

□Erin Crowley Q實驗室

一系列的微生物都可能對食物造成污染，如細菌、酵母菌、霉菌和寄生蟲等。常見的食源性致病菌包括沙門氏菌屬、克羅諾桿菌屬、彎曲桿菌屬，以及單核細胞增生李斯特菌等。如未能及時檢測食品中的微生物含量，食源性致病菌將會通過受污染的食物進行傳播擴散，進而爆發(fā)嚴重的疾病。通過監(jiān)測大腸桿菌、李斯特菌、酵母菌和霉菌等質(zhì)量指標，可對食品工藝衛(wèi)生情況和質(zhì)量進行評價。如今，用于識別食品中微生物的技術(shù)種類繁多，包括傳統(tǒng)的基于培養(yǎng)的方法、使用聚合酶鏈反應(PCR)試驗的分子檢測方法，以及日益復雜的分析技術(shù)，如質(zhì)譜法(MS)。然而，研究人員和測試制造商仍試圖尋找更為先進的方法，希望以更高的準確性和靈敏度進行更快速的測試。

質(zhì)譜的發(fā)展

歷經(jīng)多年發(fā)展，食品工業(yè)已經(jīng)習慣于使用經(jīng)AOAC或ISO 16140認可的快速檢測方法——這些定性或定量方法被食品安全管理機構(gòu)所接受，且區(qū)域法規(guī)也對其予以認可，并鼓勵將它們應用于各種各樣的食品。新技術(shù)的發(fā)展，如基質(zhì)輔助激光解吸/電離(MALDI)飛行時間(TOF)質(zhì)譜或測序技術(shù)憑借其更快速、更可靠的結(jié)果被大范圍應用，促使食品微生物檢測技術(shù)進入新的紀元。

檢測時間的長短往往是考量食品微生物實驗室合格與否的關(guān)鍵因素之一，因此，MALDI-TOF MS快速準確地確認與鑒定微生物的能力在常規(guī)測試中具有極高價值。對比研究表明，在準確鑒定細菌和真菌方面，MALDI-TOF MS(100%)與傳統(tǒng)鑒定板(94%~97%)存在差異——MALDI-TOF MS在速度及試劑成本方面擁有較大優(yōu)勢。

Q實驗室(美國俄亥俄州辛辛那提市)自1966年就服務于食品、化妝品、制藥、保健美容和膳食補充劑行業(yè)，可以提供全面的微生物學、化學實驗室及研發(fā)服務。作為一家將先進的技術(shù)與個人服務和關(guān)注相結(jié)合的獨立實驗室，Q實驗室致力于提供滿足所有測試和質(zhì)量保證需求的服務。近期，Q實驗室的微生物食品實驗室采用MALDI-TOF MS進行日常食品微生物測試及研發(fā)(R&D)工作。微生物鑒定實驗室使用標準的“工具箱”方法，其中包括標準的臺式培養(yǎng)法、自動生化法、鏡檢和16S rDNA測序法等。近年來，行業(yè)對微生物鑒定技術(shù)的內(nèi)部審查及用戶對先進替代方法的應用需求不斷提升，促進了采用MS進行鑒定工作的推進。由于實驗室承接專家鑒定機構(gòu)外包業(yè)務，因此成立了技術(shù)進步小組(TAG)，專門負責審查當前使用和未來將要實施的技術(shù)。

在這一行動中，食品微生物學工作被劃分為兩部分，即常規(guī)測試與研發(fā)(R&D)，前者由用戶提交樣品以確認并鑒定食品中的微生物，后者則是對用戶希望推廣和銷售的診斷分析方法進行驗證以獲得認證。

圖1 從?MALDIBiotyper(MBT)獲得的圖譜示例

MALDI-TOF MS常規(guī)測試

2017年1月，微生物食品實驗室將MALDI-TOF MS添加到其用于常規(guī)微生物鑒定與研發(fā)的工具箱中。該技術(shù)能夠獲得微生物的特征蛋白質(zhì)指紋圖譜，并將指紋圖譜與覆蓋面廣泛的數(shù)據(jù)庫中的數(shù)千個參考圖譜相匹配，從而準確可靠地鑒定特定目標微生物。此外，利用現(xiàn)有技術(shù)可對該工具箱進行補充，例如，使用rDNA測序方法鑒定微生物序列。

MALDI-TOF MS技術(shù)使實驗室能夠擁有靈活的周轉(zhuǎn)時間(TAT)和成本選項，以適應用戶的檢測需求。這樣一來，實驗室就能進行完全定制化的服務，如鑒于菌種快速鑒定的需要——有些工作需要當天完成，MS技術(shù)可做到這一點，而傳統(tǒng)方法則無法實現(xiàn)。MALDI-TOF系統(tǒng)檢測結(jié)果更高的準確性及更靈敏度意味著重復測試次數(shù)更少，因此在第一次得到鑒定結(jié)果時，用戶可當即作出判定。

在發(fā)生病原菌污染的情況下，傳統(tǒng)的生化測試方法需要3~7天才能確定病原菌的種類與數(shù)量。如病原菌檢測結(jié)果預判為陽性，那么如何縮短確認結(jié)果所需的時間將變得十分關(guān)鍵，MALDI-TOF MS可有效避免產(chǎn)品召回的延誤，并延緩感染性微生物的爆發(fā)。該技術(shù)可在30分鐘至2小時完成樣品分析，用于確認某種替代方法的疑似結(jié)果，或從平板上直接鑒定微生物。

驗證新的分析方法

常規(guī)實驗室測試樣品來自食品，而研發(fā)實驗室測試的“樣品”則是技術(shù)本身。技術(shù)公司及診斷合作伙伴將新的技術(shù)或分析方法帶到Q實驗室進行方法驗證，包括沙門氏菌、李斯特菌或軍團菌的檢測等，并要求對其工作提出建議。Q實驗室的用戶和方法驗證組織(如美國的AOAC INTERNATIONAL)制定了一種研究設(shè)計，其滿足AOAC附錄J指南要求——MicroVal和AFNOR認證是歐洲的認證機構(gòu)，采用的方法按ISO 16140標準進行評估;“專家實驗室”(Q實驗室)與技術(shù)提供商合作制定方法、并將其提交到認證機構(gòu)以供技術(shù)審核員批準。Q實驗室是北美唯一被AOAC、MicroVal和AFNOR這3個主要認證機構(gòu)認可的專家實驗室，這使AOAC/ISO聯(lián)合驗證研究的設(shè)計，以及滿足所有用戶需求成為可能。

協(xié)作研究

在AOAC-OMA研究或ISO 16140驗證研究中，需要選取一個領(lǐng)先的內(nèi)部實驗室(如微生物研發(fā)實驗室)進行對比協(xié)作研究，即對技術(shù)的重現(xiàn)性進行測驗，這就需要在全世界招募12~15個實驗室同意自愿對收到的盲樣進行測試。在這一項目中，所有實驗室需在同一天使用相同的技術(shù)對樣品進行評估，分析完成后，各實驗室將數(shù)據(jù)提交給主導實驗室進行統(tǒng)計分析，然后為用戶生成一份完整報告，并提交給認證機構(gòu)。最后，由技術(shù)委員會進行審查并在協(xié)商一致后批準，此項批準意味著該方法適用于預定目的并滿足驗證要求。

Q實驗室對Bruker的MALDI Biotyper(MBT)進行了AOAC-OMA和ISO 16140的驗證，并通過結(jié)合現(xiàn)行指南(AOAC附錄J指南與新的ISO 16140第6部分標準)創(chuàng)建了一個優(yōu)化研究設(shè)計以驗證MBT在食品微生物分析中的應用。由于對確認與鑒定方法設(shè)計的驗證尚未能夠跟上最新的技術(shù)發(fā)展，這一研究成為該領(lǐng)域的首個相關(guān)研究應用。表1給出了提交AOAC-OMA和ISO 16140批準的MBT合作研究的設(shè)計及結(jié)果匯總。

Q實驗室于2017年12月獲取了MBT的AOAC-OMA研究結(jié)果，成為兩項獨立研究的主導實驗室——第一種是確認與鑒定沙門氏菌、克羅諾桿菌和其它革蘭氏陰性細菌;第二種為確認與鑒定食品微生物中的單核細胞增生李斯特菌、李斯特菌屬和其它革蘭氏陽性細菌。作為MicroVal批準的ISO 16140專家實驗室，Q實驗室在2018年初組織了首次研究，并獲得4項證書;2018年4月，其在斯德哥爾摩舉行的食品保護內(nèi)部協(xié)會(IAFP)活動上，分別以海報和研討會的形式，與MicroVal技術(shù)委員會成員共同發(fā)布了該結(jié)果。

因持有AOAC官方分析方法，以及ISO驗證/MicroVal認證級別的認證，MALDI-TOF MS方法被食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)接受并用于病原菌的確認，符合歐洲法規(guī)EC 2073/2005。并且，F(xiàn)DA和歐洲法規(guī)都要求第三方認證機構(gòu)批準驗證數(shù)據(jù)，并將其視為與其現(xiàn)有確認/鑒定方法(被視為金標準)具有同等效力的替代方法。

微生物確認與鑒定的未來

一直以來，質(zhì)譜法都是一種分析化學工具，其最近通過了AOAC-OMA和ISO 16140認證，這證明了在微生物學家掌握下的MBT具有可靠性、穩(wěn)定性和重現(xiàn)性。因此，將MALDI-TOF MS應用到常規(guī)測試工作流程中可實現(xiàn)重大的資源整合，并將取代多種傳統(tǒng)的生化鑒定方法，進而消除DNA測序中的大量步驟、及工作站計量要求帶來的負擔。在分析前，檢測人員無需知曉目標微生物的類型，因為細菌、酵母菌或霉菌都將按照相同的工作流程同時進行分析。

由于用戶對食品和環(huán)境污染物的鑒定需求不斷上升，Q實驗室正在擴大其通過MALDI-TOF MS和rDNA測序提供的確認與鑒定服務，并尋求增加其環(huán)境測試服務。對于一個分離的菌落，可在15分鐘內(nèi)獲得確認/鑒定結(jié)果，而對于一整塊MALDI靶板樣品如95個樣品，僅需不到1小時即可獲得結(jié)果。當時間對決策者至關(guān)重要時，擁有此技術(shù)可提高危機應對能力。