□ 萬(wàn)宇平 馬玉華 賈芳芳 王琳琛 北京勤邦生物技術(shù)有限公司 北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心

食品安全問(wèn)題一直是社會(huì)各界關(guān)注的重點(diǎn)。世界衛(wèi)生組織曾報(bào)道稱，食源性疾病是受全球關(guān)注的衛(wèi)生問(wèn)題，更是影響人類健康的重要因素，而病原微生物感染則是導(dǎo)致食源性疾病發(fā)生的主要因素。阪崎腸桿菌在2002年被國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)(ICMSF)確定為食源性致病菌，如被阪崎腸桿菌感染可能會(huì)引起嬰幼兒尤其是新生兒患病，如腦膜炎、菌血癥及壞死性小腸結(jié)腸炎等，更有甚者會(huì)引起嚴(yán)重的后遺癥或死亡。有數(shù)據(jù)顯示，目前只有嬰幼兒奶粉與這一疾病的爆發(fā)相關(guān)。

傳統(tǒng)的致病微生物檢測(cè)方法有國(guó)標(biāo)法和紙片法，但因操作復(fù)雜且測(cè)試周期過(guò)長(zhǎng)，其已經(jīng)無(wú)法跟上經(jīng)濟(jì)發(fā)展的步伐，不能滿足我國(guó)快速發(fā)展的食品行業(yè)對(duì)食品檢測(cè)工作的需求。因此，建立一種在嬰幼兒奶粉中快速、高效、靈敏的檢測(cè)阪崎腸桿菌的方法至關(guān)重要。

本研究是一種基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)而開(kāi)發(fā)的快速檢測(cè)食品中阪崎腸桿菌的方法。環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Loop Mediated Isothermal Amplification，以下簡(jiǎn)稱“LAMP法”)是日本榮研株式會(huì)社研究發(fā)明的核酸等溫?cái)U(kuò)增方法，其利用4個(gè)特殊的引物特異識(shí)別靶基因的6個(gè)特定區(qū)域，采用具有強(qiáng)鏈置換活性的BstDNA聚合酶，實(shí)現(xiàn)在恒溫條件下的體外擴(kuò)增。本研究根據(jù)阪崎腸桿菌的16-23S基因設(shè)計(jì)了6條引物，并將其與目的基因的6個(gè)區(qū)域相結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。本試劑盒能在60min內(nèi)完成擴(kuò)增反應(yīng)，且技術(shù)要求低，具有快速、簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，能有效解決傳統(tǒng)檢測(cè)方法耗時(shí)長(zhǎng)、結(jié)果可靠性差等問(wèn)題，適合各級(jí)實(shí)驗(yàn)室及基層單位推廣使用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

引物、DNA聚合酶、dNTP、MgSO4、Buffer緩沖液、顯色劑、DNA提取液。

PCR擴(kuò)增儀。

1.2 環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系

1.2.1 制備環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)體系

6條引物分別如下：內(nèi)引物1為5' -TAGCCAACCGATGTTTCTGTATCAA-ACAATACTACAAAGGTGCTTTCG-3'(SEQ ID No.1);內(nèi)引物2為5' -AGAAGTCATTAGCGAACAGGCTAC-GCGTAAGATTCTTGCTCAGTAG -3'(SEQ ID No.2);外引物1為5'- GTGAGAACGGGACCATCA -3'(SEQ ID No.3);外引物2為5'- CTTGTTTTTGTAGGGTTTGGA- 3'(SEQ ID No.4);環(huán)引物1為5'-GACTTCTTCGGGTTGTGAGG- 3'(SEQ ID No.5);環(huán)引物2為5'- GATTAGCACGTCCTTCATCG- 3'(SEQ ID No.6)。

DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，濃度為8U/μL;dNTP：濃度為25mM;MgSO4：濃度為50mM;Buffer緩沖液：10×buffer;顯色劑：熒光染料1000×SYBR Green I;DNA提取液。

1.2.2 鑒定阪崎腸桿菌與非阪崎腸桿菌

本實(shí)驗(yàn)所述待檢樣品為添加阪崎腸桿菌的奶粉樣本。

模板DNA提取：將1mL的樣本置于1.5mL離心管;12000r/min離心2min，棄上清;然后加入DNA提取液80μL，煮沸10min;最后離心取上清液轉(zhuǎn)移至另一支離心管中作為模板DNA。

環(huán)介導(dǎo)等溫基因擴(kuò)增反應(yīng)：在200μL PCR管配制反應(yīng)體系，外引物終濃度為0.2µM，內(nèi)引物、環(huán)引物終濃度為0.6µM，1×buffer反應(yīng)緩沖液，3mM MgSO4，0.5mM dNTP，8U Bst DNA聚合酶，樣本模板2.5µL，超純水補(bǔ)足25µL，然后加入30µL的密封液，將上述反應(yīng)管于65℃反應(yīng)60min。

結(jié)果判定：在上述反應(yīng)管中加入1μL 1000×SYBR Green I，混勻后觀察反應(yīng)液的顏色，若呈現(xiàn)綠色則為阪崎腸桿菌，橙色則為非阪崎腸桿菌。

檢測(cè)結(jié)果：PCR管呈現(xiàn)綠色，表明待檢樣品所感染的致病菌為阪崎腸桿菌。

1.3特異性與靈敏度

1.3.1檢測(cè)材料及方法

菌株：金黃色葡萄球菌ATCC 6538、單增李斯特菌CMCC(B) 54002、副溶血性弧菌 ATCC 17802、福氏志賀氏菌CMCC(B) 51572、鼠傷寒沙門氏菌ATCC 14028、阪崎腸桿菌CMCC 45410、陰溝腸桿菌CMCC45301、赫氏艾希氏菌、肺炎克雷伯氏菌、大腸埃希氏菌O157H7 ATCC 43888、大腸埃希氏菌25922、威氏李斯特CICC21672、綿羊李斯特CICC21633、格氏李斯特CICC21670。

食品樣本：幼兒配方奶粉、米粉、營(yíng)養(yǎng)快線、奶片、鈣奶餅干。

檢測(cè)方法：對(duì)各個(gè)樣本的檢測(cè)嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，同時(shí)與國(guó)標(biāo)方法GB 4789.40-2010進(jìn)行對(duì)比。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性

對(duì)常見(jiàn)食源性致病菌菌株及同源性高的菌株提取基因組DNA(按說(shuō)明書(shū)制備基因組DNA)，采用核酸檢測(cè)試劑盒進(jìn)行單一和交叉污染檢測(cè)，每個(gè)樣品均進(jìn)行2次重復(fù)檢測(cè)，并同時(shí)設(shè)立檢測(cè)試劑盒的陰性和陽(yáng)性對(duì)照。(見(jiàn)表1)

結(jié)果顯示，僅含阪崎腸桿菌的樣品顯示陽(yáng)性結(jié)果，其余樣品均為陰性，表明該試劑盒具有高度特異性。

2.2 靈敏度

純菌靈敏度(CFU/mL)：取計(jì)數(shù)后菌液進(jìn)行梯度稀釋(100μL菌液+900μL超純水)，按說(shuō)明書(shū)提取DNA模板。取不同濃度梯度測(cè)試，每個(gè)梯度作兩個(gè)平行。

實(shí)際樣本靈敏度[CFU/25g(mL)]：取計(jì)數(shù)后菌液進(jìn)行梯度稀釋(100μL菌液+900μL超純水)，分別取約≥10CFU、<10CFU稀釋液進(jìn)行樣本添加，置于均質(zhì)袋內(nèi)，按國(guó)標(biāo)方式培養(yǎng)后，取200μL培養(yǎng)液上清提取模板檢測(cè)。

2.2.1純菌靈敏度(見(jiàn)表2)

結(jié)果顯示：純菌靈敏度數(shù)量級(jí)為102，但大量實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，由于模板提取、稀釋誤差等原因，靈敏度數(shù)量級(jí)可能為103。因此，純菌靈敏度約為102~103CFU/mL。

2.2.2實(shí)際樣本靈敏度(見(jiàn)表3)

結(jié)果顯示，實(shí)際樣本的靈敏度均可達(dá)到≤10CFU/25g，個(gè)別樣本靈敏度試劑盒方法高于國(guó)標(biāo)方法。

2.3 批間、批內(nèi)差(“+”為陽(yáng)性、“-”為陰性)

以嬰幼兒配方奶粉為樣本，進(jìn)行不同量的陽(yáng)性菌添加(無(wú)添加、≥10CFU、<10CFU)并制備成不同濃度的樣品，每個(gè)樣品作3個(gè)平行，3次重復(fù)，測(cè)試3批檢測(cè)試劑，同時(shí)設(shè)立陰陽(yáng)對(duì)照組。(見(jiàn)表4)

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，按照公式計(jì)算，試劑盒的批內(nèi)差為0%，批間差為0%，說(shuō)明試劑盒穩(wěn)定性較好。

2.4 國(guó)標(biāo)符合率

以嬰幼兒配方奶粉、奶片、營(yíng)養(yǎng)快線、鈣奶餅干、米粉為樣本，使用不同濃度陽(yáng)性菌進(jìn)行樣本添加，采用核酸檢測(cè)試劑盒與國(guó)標(biāo)方法同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的檢測(cè)結(jié)果，每個(gè)檢測(cè)樣本進(jìn)行3個(gè)重復(fù)檢測(cè)，同時(shí)設(shè)立試劑盒的陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照。(見(jiàn)表5)

結(jié)果顯示，不同樣本的檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)一致。因此，試劑盒檢測(cè)方法與國(guó)標(biāo)檢測(cè)方法的符合率為100%。

3 驗(yàn)證評(píng)價(jià)

驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)表明，北京勤邦生物技術(shù)有限公司研發(fā)的阪崎腸桿菌核酸檢測(cè)方法簡(jiǎn)單、快捷，不需要大型儀器設(shè)備;純菌檢測(cè)靈敏度為102~103CFU/mL，實(shí)際樣本靈敏度均可達(dá)到≤10CFU/25g，試劑盒具有較高特異性，產(chǎn)品批內(nèi)及批間無(wú)明顯差異，實(shí)際樣本檢測(cè)國(guó)標(biāo)符合率為100%。