□ 陶文靖 胡素麗 北京美正生物科技有限公司

□ 趙婷婷 光明乳業(yè)股份有限公司華東中心工廠

□ 付敏 中農(nóng)孚德檢測技術(北京)有限公司

摘　要：本文通過對芽孢液體發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定了嗜熱脂肪芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基的最佳配比：0.8%蛋白胨、0.3%酵母粉、0.3%NaCl、Mn2+0.9mmol/L、Ca2+10mmol/L;最佳發(fā)酵條件：pH7.0、接種量0.1%、裝液量100mL、培養(yǎng)時間24h、溫度65℃。對優(yōu)化后的綜合條件進行檢測實驗，結(jié)果顯示，液體發(fā)酵產(chǎn)孢率可達48%左右，較優(yōu)化之前提高15%左右。

關鍵詞：嗜熱脂肪芽孢桿菌 液體發(fā)酵 培養(yǎng)基 產(chǎn)孢率

1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的介紹

1.1 嗜熱脂肪芽孢桿菌的特性

1917年Smith等在實驗室分離出嗜熱脂肪芽孢桿菌，1920年Donk將其歸類于芽孢桿菌屬(Bacillus)并以嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)來命名[1]。2001年，Nazina等將包括嗜熱脂肪芽孢桿菌在內(nèi)的6種菌株從芽孢桿菌屬分離出來，并歸類為芽孢桿菌屬(Geobacillus)，目前該屬已經(jīng)被國際所公認[2]。ATCC、DSMZ，以及國際權(quán)威標準和藥典等已經(jīng)將嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)更名為嗜熱脂肪土芽孢桿菌(Geobacillus stearothermophilus)，但中國依然習慣稱其為嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)。

嗜熱脂肪芽孢桿菌是革蘭氏陽性細菌，該菌營養(yǎng)細胞呈長桿、圓端狀，多數(shù)為單菌落，少數(shù)會成對或呈鏈狀排列[3]。嗜熱脂肪芽孢桿菌的最佳生長溫度為56~60℃，最高生長溫度為65~75℃，最低生長溫度為35~45℃。此外，該菌是需氧或兼性厭氧菌，消耗葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣，其最適pH值為6.8~7.2，當pH值接近5時該菌就不能生長[4]。培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分對芽孢生成率有明顯的影響——在培養(yǎng)基中加入無機離子可提高芽孢產(chǎn)率和芽孢熱抗力，如鈣離子濃度增加可使芽孢的熱抗力增強[1]。

1.2 嗜熱脂肪芽孢桿菌的應用

嗜熱脂肪芽孢桿菌可以作為生物指示劑，由于其產(chǎn)生的孢子具有非致病性、無熱原、無毒等特性，并且耐高溫和高壓，因此被歐洲藥典、美國藥典和日本藥典用作熱滅菌生物指示劑。我國也將該菌株列入《消毒與滅菌效果的評價方法與標準》(GB 5981-1995)和《消毒技術規(guī)范》(2002版)[5]。此外，該菌還被廣泛應用于牛奶中抗生素的檢測[6]，乳品中抗生素試劑盒應用的檢測方法就是依據(jù)嗜熱脂肪芽胞桿菌生長、萌發(fā)產(chǎn)酸使培養(yǎng)基的顏色發(fā)生改變的原理，將其作為檢測指標。

2 儀器與材料

2.1 實驗儀器

超凈工作臺：江蘇蘇凈安泰有限公司;pH測試計：ALALIS安萊立思;恒溫搖床：上海一恒科學儀器有限公司;電子天平：梅特勒-托利多國際貿(mào)易(上海)有限公司;滅菌鍋：上海三申醫(yī)療器械有限公司;磁力攪拌器：IKA儀科;恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司;顯微鏡：奧林巴斯(北京)銷售服務有限公司。

2.2 實驗材料和試劑

蛋白胨：北京陸橋技術有限責任公司;酵母粉：北京陸橋技術有限責任公司;NaCl、CaCl2等：北京陸橋技術有限責任公司;NaOH：國藥集團化學試劑有限公司。

3 實驗方法

3.1 菌株的活化培養(yǎng)

在無菌條件下用接種環(huán)取一環(huán)誘變后的HY嗜熱脂肪芽孢桿菌，接入含有50mL配有培養(yǎng)基的150mL三角瓶里，置于60℃、140rpm/min的條件下在水浴搖床培養(yǎng)18h，制備種子液。

3.2 芽孢鏡檢及產(chǎn)率計算

①玻片制備：取一片干凈的載玻片，于中央處滴加1滴無菌水，在超凈工作臺內(nèi)用接種針取菌膜涂于水滴內(nèi)并混勻。載玻片用酒精燈的外焰過火加熱直至菌膜干涸。

②染色：滴加7.6%的孔雀石綠染液于菌膜上，待看到染液上方發(fā)煙后開始計時，并不停補色，5min后用細水流沖洗玻片一端，然后用洗耳球吹干水分。滴沙黃復染液，染色5min，沖洗玻片后吹干。

③觀察：打開顯微鏡，用100倍油鏡觀察。在視野中可看到菌體被染成紅色，芽孢被染成綠色。觀察結(jié)束后，用蘸有乙醚酒精液的擦鏡紙擦拭鏡頭。

芽孢產(chǎn)率計算公式如下：

該式中，Z為芽孢產(chǎn)率;M1為芽孢數(shù);M2為細菌數(shù)。

3.3 產(chǎn)孢培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的優(yōu)化

設定基礎培養(yǎng)基成分配比及產(chǎn)孢條件：0.5%蛋白胨、0.6%酵母粉、0.3%NaCl、pH7.0、接種量0.1%、裝液量100mL、培養(yǎng)時間24h、培養(yǎng)溫度60℃。通過單因素實驗對基礎培養(yǎng)基成分進行實驗優(yōu)化，分別設置實驗條件因素如下：

①蛋白胨濃度分別為0.5%、0.8%、1.0 %、1.2%、1.5%、1.8%;

②酵母膏濃度分別為0.3%、0.4%、0.5%、0.6%、0.7%;

③NaCl濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%;

④添加MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L;

⑤添加CaCl2濃度分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L;

⑥添加FeSO4·7H2O濃度分別為0、1、2.5、5、7.5、10mmol/L;

⑦pH分別選擇至6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4。

分別取100mL培養(yǎng)基裝入250mL的錐形瓶中，將活化后的嗜熱脂肪芽孢桿菌種子液以0.1%的接種量接種到培養(yǎng)基中，置于培養(yǎng)箱中，將溫度調(diào)至60℃培養(yǎng)24h，通過芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產(chǎn)率，以芽孢產(chǎn)率為指標，重復3次實驗，確定培養(yǎng)基中營養(yǎng)成分配比。

3.4 產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的優(yōu)化

以3.3中得到的最優(yōu)培養(yǎng)基組分為基礎，進行發(fā)酵條件(溫度、時間、接種量)優(yōu)化。通過單因素實驗對產(chǎn)孢條件進行實驗優(yōu)化，分別設置實驗條件因素如下：

①培養(yǎng)溫度分別設置為55、60、65、70、75℃;

②培養(yǎng)時間分別設置為16、20、24、32、36、40h;

③接種量分別設置為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%。

通過芽孢染色和顯微鏡鏡檢的方法估算芽孢產(chǎn)率，以芽孢產(chǎn)率為指標，重復3次實驗，確定最佳產(chǎn)孢條件。

3.5 優(yōu)化后條件的驗證

對經(jīng)過3.3和3.4實驗優(yōu)化所得到的最優(yōu)條件進行組合，進行5次芽孢發(fā)酵實驗，對芽孢產(chǎn)率進行驗證。

4結(jié)果與分析

4.1 培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的確定

4.1.1蛋白胨濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以最初培養(yǎng)基組成比例為基礎，更改蛋白胨的含量分別為0.5%、0.8%、1.0%、1.2%、1.5%、1.8%，結(jié)果如圖1所示。

由圖1結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，隨著蛋白胨濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之升高。當?shù)鞍纂藵舛葹?.8%時，芽孢產(chǎn)率達到最高，為37.1%;當?shù)鞍纂藵舛却笥?.0%時，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。所以，確定以0.8%蛋白胨濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

4.1.2酵母膏濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數(shù)為前提，更改酵母膏的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，結(jié)果如圖2所示。

由圖2結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨酵母膏濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當酵母膏濃度在0.3%時，芽孢產(chǎn)率達到最高，為34.2%;當酵母膏濃度大于0.3%時，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。通過此實驗，確定以0.3%酵母膏濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

4.1.3 NaCl濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數(shù)為前提，更改NaCl的濃度分別為0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%，結(jié)果如圖3所示。

由圖3結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨NaCl濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當NaCl濃度在0.3%時，芽孢產(chǎn)率達到最高，為34.7%;當NaCl濃度大于0.3%時，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。通過此實驗，確定以0.3%NaCl濃度作為以下產(chǎn)孢培養(yǎng)基的成分。

4.1.4 Mn2+濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數(shù)為前提，更改MnSO4濃度分別為0、0.1、0.3、0.5、0.7、0.9、1.1、1.3mmol/L，結(jié)果如圖4所示。

由圖4結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨Mn2+濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當Mn2+濃度為0.9mmol/L時，芽孢產(chǎn)率達到最高，為42.6%;當Mn2+濃度大于0.9mmol/L時，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。因此，確定產(chǎn)孢培養(yǎng)基中Mn2+的添加量為0.9mmol/L。

4.1.5 Ca2+濃度的確定

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數(shù)為前提，增加CaCl2 分別為0、2.5、5、7.5、10、12.5、15mmol/L，結(jié)果如圖5所示。

由圖5結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨Ca2+濃度的加大，芽孢產(chǎn)率隨之提高。當Ca2+濃度為10mmol/L時，芽孢產(chǎn)率達到最高，為47.2%;當Ca2+濃度大于10mmol/L時，芽孢產(chǎn)率隨之呈現(xiàn)下降趨勢。通過此實驗，確定產(chǎn)孢培養(yǎng)基中Ca2+的添加量為10mmol/L。

4.1.6 Fe2+濃度

依照3.3的實驗方案，以前述實驗確定的參數(shù)為前提，增加FeSO4·7H2O濃度分別為0、1、2.5、5、7.5、10、12.5mmol/L，結(jié)果如圖6所示。

由圖6結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，伴隨Fe2+濃度的加大，芽孢產(chǎn)率并沒有顯著提高，反而對芽孢生長有輕微抑制，所以放棄添加Fe2+。

4.1.7 pH值的確定

依照3.3的實驗方案，在以上述確定的參數(shù)為前提下，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基的pH值分別為6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4，結(jié)果如圖7所示。

由圖7結(jié)果顯示，當pH偏酸性時，芽孢的形成受到抑制。當pH為7.0時芽孢產(chǎn)率最高，為47.2%;當pH高于7.0時，芽孢產(chǎn)率逐漸降低，因此產(chǎn)孢最佳pH為7.0。

通過3.3的實驗，確定培養(yǎng)基營養(yǎng)成分的基本配比為：蛋白胨濃度0.8%、酵母膏濃度0.3%、NaCl濃度0.3%、Mn2+濃度為0.9mmol/L、Ca2+濃度為10mmol/L、pH為7.0，以此作為接下來產(chǎn)孢培養(yǎng)實驗的培養(yǎng)基成分，繼續(xù)優(yōu)化產(chǎn)孢培養(yǎng)條件。

4.2產(chǎn)孢培養(yǎng)條件的確定

4.2.1產(chǎn)孢培養(yǎng)溫度的確定

根據(jù)3.4的實驗方案，進行培養(yǎng)溫度對芽孢產(chǎn)率的實驗，培養(yǎng)溫度分別設置為55、60、65、70、75℃，結(jié)果如圖8所示。

由圖8結(jié)果顯示，在菌株適應生長范圍內(nèi)，隨著溫度的提升，芽孢產(chǎn)率有一定的提高，當溫度在65℃時芽孢產(chǎn)率最高，為49.7%;當溫度高于65℃時，芽孢產(chǎn)率逐漸降低，因此產(chǎn)孢最佳培養(yǎng)溫度為65℃。

4.2.2產(chǎn)孢培養(yǎng)時間的確定

根據(jù)3.4的實驗方案，進行培養(yǎng)時間對芽孢產(chǎn)率影響的實驗，培養(yǎng)時間設為16、24、32、36、40h，每隔2~4h進行測試，結(jié)果如圖9所示。

由圖9結(jié)果顯示，當培養(yǎng)時間為24~28h時，芽孢產(chǎn)率達到48%以上;當培養(yǎng)時間超過32h時，芽孢產(chǎn)率出現(xiàn)降低趨勢。分析出現(xiàn)這種趨勢的原因可知，隨著時間的變化，其培養(yǎng)基的營養(yǎng)成分已經(jīng)不足以維持菌體的生長繁殖，且菌體逐漸走向衰亡期，活的菌體變少了，所轉(zhuǎn)化的芽孢便會減少。因此，產(chǎn)孢培養(yǎng)的最佳時間為24~28h。

4.2.3接種量條件的確定

根據(jù)3.4的實驗方案，進行接種量對芽孢產(chǎn)率的實驗，接種量分別為0.03%、0.06%、0.1%、0.2%、0.4%，結(jié)果如圖10所示。

由圖10結(jié)果顯示，在一定范圍內(nèi)，隨著接種量的增加，芽孢產(chǎn)率也隨之增加，當接種量為0.1%時，芽孢產(chǎn)率最高，為49.7%。當接種量超過0.1%時，芽孢產(chǎn)率降低，這可能是因為培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)是一定的，當菌體數(shù)量太多時，培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)無法滿足菌體的生長需求，會嚴重影響嗜熱芽孢桿菌轉(zhuǎn)化成芽孢的能力，因此最佳接種量為0.1%。

4.3 芽孢產(chǎn)率的確定

根據(jù)3.5的實驗方案，進行芽孢發(fā)酵實驗，進行5次平行實驗，實驗結(jié)果如圖11顯示，經(jīng)過條件優(yōu)化后，芽孢產(chǎn)率平均可以達到47.8%。

5 結(jié)果與討論

通過單因素實驗對嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)條件進行優(yōu)化，研究了產(chǎn)孢培養(yǎng)基組成成分(蛋白胨、酵母粉、NaCl、Mn2+、Ca2+、Fe2+、pH)以及產(chǎn)孢培養(yǎng)條件(溫度、時間、接種量)，以提高嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢率。

本文確定了嗜熱芽孢桿菌產(chǎn)孢培養(yǎng)基最佳配比：蛋白胨為0.8%、酵母粉為0.3%、NaCl為0.3%、Mn2+為0.9mmol/L、Ca2+為10 mmol/L、pH7.0、接種量為0.1%、裝液量為100mL、培養(yǎng)時間為24 h、溫度為65℃。Fe2+的添加對芽孢產(chǎn)率無促進作用。隨后通過組合條件的驗證，最終液體發(fā)酵產(chǎn)孢率可穩(wěn)定在47.8%左右，較優(yōu)化之前提高10 %以上。液體發(fā)酵雖然產(chǎn)孢率不如固體發(fā)酵高，但操作簡單，一次可得到的芽孢量遠遠大于固體發(fā)酵。該方法能夠提高試劑盒生產(chǎn)企業(yè)的工作效率并降低原材料成本。但目前產(chǎn)孢率仍然偏低，還需要進一步優(yōu)化。

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