淺談食品微生物檢驗(yàn)中菌落總數(shù) 和大腸菌群測定注意事項(xiàng)

2019-09-30 11:13:17 來源：食品安全導(dǎo)刊

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　　摘要：當(dāng)今，食品安全問題已經(jīng)成為關(guān)系廣大人民群眾健康利益的重大問題，我國食品安全問題形勢嚴(yán)峻，引起了國家的高度重視，其中食品微生物污染問題歷年來居于食品不合格問題的前列。本文就食品微生物學(xué)檢驗(yàn)中常檢項(xiàng)目菌落總數(shù)和大腸菌群測定應(yīng)注意的事項(xiàng)進(jìn)行分析與探討，希望對同行有所借鑒。

　　關(guān)鍵詞：食品微生物檢驗(yàn)；菌落總數(shù)；大腸菌群；注意事項(xiàng)

　　隨著社會的發(fā)展，人們對食物質(zhì)量要求也越來越高，“吃得好”已經(jīng)成為大家的普遍需求，而食品質(zhì)量安全又是“吃得好”的前提。然而，食品企業(yè)在生產(chǎn)加工過程如果未能嚴(yán)格按照要求控制衛(wèi)生條件，或者包裝容器清洗消毒不到位，亦或儲運(yùn)過程不當(dāng)，極易引起產(chǎn)品的微生物指標(biāo)超標(biāo)，從而使食用者健康受到危害。

　　當(dāng)前，在我國食品安全監(jiān)督抽檢中微生物檢驗(yàn)項(xiàng)目主要有菌落總數(shù)、大腸菌群、霉菌和酵母、致病菌4類。菌落總數(shù)反映食品被細(xì)菌污染的程度；大腸菌群反映食品是否有被糞便污染；霉菌和酵母可使食品腐敗變質(zhì)，并產(chǎn)生真菌毒素危害人體健康；致病菌可能引起食物中毒。其中，菌落總數(shù)和大腸菌群項(xiàng)目為科學(xué)評價食品衛(wèi)生質(zhì)量的重要指標(biāo)，是絕大部分食品的必檢項(xiàng)目。在2019年上半年市場監(jiān)管總局公布的不合格食品中，菌落總數(shù)超標(biāo)和大腸菌群超標(biāo)占微生物超標(biāo)總數(shù)比例分別為60.78%和11.76%[[[] 王嘉. 2019年上半年市場監(jiān)管總局共公布不合格食品256批次，這七大類問題企業(yè)要關(guān)注 [N]. 中國質(zhì)量報, 2019-06-28(6).]]。因此，為保障人民群眾的健康安全，必須提高菌落總數(shù)和大腸菌群檢測的準(zhǔn)確性。筆者結(jié)合工作實(shí)際，就食品中菌落總數(shù)和大腸菌群測定應(yīng)注意的事項(xiàng)進(jìn)行闡述，希望對同行有所借鑒。

　　檢驗(yàn)方法選擇

　　選擇正確的檢驗(yàn)方法是檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠的前提。目前，食品中菌落總數(shù)測定的方法主要是GB 4789.2-2016，但是生活飲用水菌落總數(shù)測定方法卻為GB/T 5750.12-2006。這兩個標(biāo)準(zhǔn)最大的不同在于選用的培養(yǎng)基，GB 4789.2-2016 中為平板計數(shù)瓊脂（PCA），而GB/T 5750.12-2006 中為營養(yǎng)瓊脂（NA）。兩者的區(qū)別在于平板計數(shù)瓊脂更利于細(xì)菌的恢復(fù)和生長，同時又能防止細(xì)菌生長連成片狀[2] 楊慶文, 國譯丹, 周惠新, 等. 不同濃度 TTC 平板計數(shù)瓊脂細(xì)菌生長試驗(yàn)觀察[J]. 中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志, 2012, 22(1): 62-63，如果采用GB 4789.2-2016測定水中菌落總數(shù)，可能導(dǎo)致測定結(jié)果偏高而使產(chǎn)品誤判。

　　對于大腸菌群檢測，現(xiàn)行的國家標(biāo)準(zhǔn)為GB 4789.3-2016，該標(biāo)準(zhǔn)包含兩種方法：MPN法和平板法。MPN法是一種半定量計數(shù)方法，適用于大腸菌群含量較低的食品的檢測；平板法為定量計數(shù)法，適用于大腸菌群含量較高的食品的檢測。正確使用這兩種方法的關(guān)鍵在于區(qū)分產(chǎn)品執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)中限度的單位：當(dāng)限度要求以“CFU/ g 或 CFU/mL”為單位時，我們應(yīng)選擇平板法；當(dāng)以“MPN/g 或 MPN/mL”為單位的，我們應(yīng)選擇MPN法。然而一些特殊的產(chǎn)品，如醬油、醋和一些保健食品，限度要求以“MPN/100mL或MPN /100g”為單位，這時我們應(yīng)選擇GB/T 4789.3-2003進(jìn)行檢測，因?yàn)樾l(wèi) 生部2009年第 16 號公告明確規(guī)定：現(xiàn)行食品標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定的大腸菌群指標(biāo)以“MPN/100克或MPN/100毫升”為單位的，適用《食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)大腸菌群測定》（GB/T4789.3-2003）進(jìn)行檢測。因此我們應(yīng)根據(jù)樣品的種類選擇正確的檢驗(yàn)方法。

　　檢樣處理與稀釋

　　菌落總數(shù)和大腸菌群的測定均應(yīng)在潔凈工作區(qū)進(jìn)行，所用器具均需嚴(yán)格滅菌。目前微生物實(shí)驗(yàn)室常用的滅菌方式主要為干熱滅菌和濕熱滅菌兩類。其中干熱滅菌是利用恒溫干燥箱內(nèi)160℃～180℃的高熱，殺死細(xì)菌和芽孢，達(dá)到滅菌目的的一種方法；濕熱滅菌是利用高壓蒸汽以及在蒸汽環(huán)境中存在的潛熱作用和良好的穿透力，使菌體蛋白質(zhì)凝固變性而使微生物死亡的一種方法。一般玻璃培養(yǎng)皿、刻度吸管以及金屬取樣工具可裝入相應(yīng)的不銹鋼消毒桶中，然后置于熱空氣消毒箱160℃~180℃干熱滅菌2h以提高工作效率，而含水物品如培養(yǎng)基、生理鹽水等則需采用濕熱滅菌的方法.。

　　樣品取樣前一定要核查樣品包裝的密封性和密封的完整性。檢驗(yàn)人員要嚴(yán)格按照規(guī)定佩帶無菌帽子、口罩、手套等，操作前用酒精棉球?qū)κ植窟M(jìn)行消毒。取樣時應(yīng)注意無菌操作，一般固體樣品從其不同部位稱取25g置于225mL無菌生理鹽水中，液體樣品則吸取25mL置于225mL無菌生理鹽水中。應(yīng)該注意的是，國標(biāo)針對不同類別食品樣品前處理還有特殊的規(guī)定：如食醋和酸性飲料，由于呈酸性，需調(diào)節(jié)pH值至中性才能進(jìn)行檢測；調(diào)味品，如醬和醬油等，由于其本身含鹽量較高，取樣及稀釋樣品時應(yīng)用無菌蒸餾水；固態(tài)、半固態(tài)乳制品取樣時應(yīng)將無菌生理鹽水預(yù)熱至45 ℃；冷凍食品取樣前應(yīng)在 45℃以下不超過 15 min , 或 2℃～ 5℃不超過 18 h 進(jìn)行解凍。

　　菌落總數(shù)和大腸菌群檢驗(yàn)常用的稀釋液為無菌生理鹽水和磷酸鹽緩沖液，一般情況下兩者可以通用，無任何區(qū)別。然而，對于一些酸性或堿性樣品，使用磷酸鹽緩沖液作為稀釋液，更利于樣品中微生物的存活和檢出[[[] 孫慧, 李天添. 使用不同稀釋液對食品中菌落總數(shù)檢測結(jié)果的影響初探[J]. 釀酒, 2012, 39(1):86-88.]]。在制備10倍系列稀釋樣品勻液過程時，我們應(yīng)根據(jù)樣品受污染程度，以及產(chǎn)品的微生物限度選擇稀釋的最低倍數(shù)。比如國標(biāo)對液態(tài)飲料菌落總數(shù)限度要求：n=5, c=2, m=100CFU/mL, M=10000CFU/mL，這時稀釋到1：100就可以判斷產(chǎn)品是否合格；而糕點(diǎn)國標(biāo)菌落總數(shù)規(guī)定：n=5, c=2, m=10000 CFU/g, M=100000 CFU/g，這時就要稀釋到1：1000測定才能進(jìn)行判斷；在盲樣測定時，由于不知道樣品具體菌落數(shù)，這時為保險起見應(yīng)多做稀釋度，一般至少稀釋到10-8才能達(dá)到計數(shù)的目的。在稀釋過程中，每遞增稀釋一次需更換一根無菌吸管或吸頭，保證稀釋倍數(shù)的準(zhǔn)確性，同時應(yīng)取空白稀釋液做陰性對照，因?yàn)榭瞻讓φ杖绻屑?xì)菌生長，說明培養(yǎng)基、稀釋液、培養(yǎng)皿滅菌及人員操作中至少有一項(xiàng)未滿足實(shí)驗(yàn)要求，檢測結(jié)果無效，應(yīng)逐一排查查明原因。

　　接種與培養(yǎng)

　　在菌落總數(shù)檢驗(yàn)接種時，應(yīng)該揭開培養(yǎng)皿的部分使檢液從側(cè)邊進(jìn)入。檢液加入后，必須盡快傾注培養(yǎng)基混勻。傾注培養(yǎng)皿的培養(yǎng)基應(yīng)保持46℃，因?yàn)闇囟冗^高培養(yǎng)皿中的細(xì)菌可能被燙死而影響結(jié)果的準(zhǔn)確性，溫度過低培養(yǎng)基將凝固。當(dāng)培養(yǎng)皿中瓊脂凝固后，將培養(yǎng)皿置于培養(yǎng)箱中36℃±1℃倒置培養(yǎng)48h±2h（水產(chǎn)品為30℃±1℃培養(yǎng)72h±3h），培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)的原因主要有3個：1.防止培養(yǎng)皿正置培養(yǎng)時水分蒸發(fā)在培養(yǎng)蓋上形成冷凝水滴落而污染培養(yǎng)基；2.倒置培養(yǎng)后瓊脂表面不會有水膜，從而促使菌落的形成；3.倒置培養(yǎng)后菌落生長速度適宜，形成的菌落容易計數(shù)。

　　在大腸菌群檢驗(yàn)過程中，平板法接種注意事項(xiàng)和菌落總數(shù)測定相似，也包括培養(yǎng)基傾注的溫度保持46℃，培養(yǎng)皿倒置培養(yǎng)。但是在使用MPN法測定前要注意杜氏扣管里是否有空氣，以免影響后續(xù)的觀察，增加工作量。在接種時應(yīng)注意，當(dāng)樣品接種體積>1mL（一般為10mL）時應(yīng)使用雙料培養(yǎng)基，而接種量≤1mL應(yīng)用單料培養(yǎng)基，這是因?yàn)榻臃N體積的增大會稀釋培養(yǎng)基使各成分濃度降低，因而使用雙料培養(yǎng)基。

　　在大腸菌群MPN法糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中，觀察是否產(chǎn)氣應(yīng)對光傾斜觀察，有時杜氏扣管中會出現(xiàn)比米粒還小的氣泡干擾檢驗(yàn)人員，這時可通過觀察發(fā)酵液是否渾濁，繼續(xù)培養(yǎng)是否產(chǎn)氣來判斷。對于GB/T 4789.3-2003，亦可通過觀察發(fā)酵液是否變黃進(jìn)行判斷，以確定是否進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。為保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性，應(yīng)同時做陰性對照、陽性對照試驗(yàn)。當(dāng)發(fā)現(xiàn)樣品初發(fā)酵陽性時，必須進(jìn)行證實(shí)試驗(yàn)，因?yàn)橛性S多研究表明，初發(fā)酵實(shí)驗(yàn)陽性的試管，證實(shí)試驗(yàn)結(jié)果可能為陰性。

　　在大腸菌群平板法驗(yàn)證試驗(yàn)中，可疑菌落的挑取驗(yàn)證往往是檢驗(yàn)人員認(rèn)為比較棘手的問題。國標(biāo)規(guī)定，挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，少于10個全部挑取，這句話常常讓檢驗(yàn)人員不知如何理解。其實(shí)這里的典型菌落主要包括大腸埃希氏菌、檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣克雷伯氏菌和陰溝腸桿菌，建議檢驗(yàn)人員初次實(shí)驗(yàn)時取這四種細(xì)菌進(jìn)行陽性對照試驗(yàn)，然后注意觀察，并記錄典型大腸菌群形態(tài)，這樣就能區(qū)分出典型菌落和可疑菌落。正式試驗(yàn)時，挑取典型菌落和可疑菌落各10個（或全部挑取）進(jìn)行驗(yàn)證，挑取菌落時可連同部分培養(yǎng)基挑出，以防漏挑。

　　計數(shù)結(jié)果

　　菌落總數(shù)和大腸菌群的計數(shù)一般按照國標(biāo)規(guī)定執(zhí)行即可。然而，在實(shí)際檢驗(yàn)工作中常常會遇到菌落蔓延整個培養(yǎng)皿而導(dǎo)致無法計數(shù)的情況。筆者結(jié)合近幾年的檢驗(yàn)經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為可以從以下幾個方面解決此問題。首先，無論是菌落總數(shù)還是大腸菌群測定，都可以在凝固后的瓊脂表面覆蓋3~4mL相應(yīng)的培養(yǎng)基防止菌落蔓延；其次，可以多做稀釋度，在高稀釋倍數(shù)計數(shù)；再次，培養(yǎng)過程中應(yīng)每天觀察，在菌落蔓延前作出記錄。特殊的，對于菌落總數(shù)測定，特殊情況下，還可以嘗試在平板計數(shù)瓊脂里面加入TTC（氯化三苯四氮唑），TTC檢測的原理是大部分細(xì)菌在代謝的過程中能產(chǎn)生脫氫酶，具有脫氫作用，可將無色的TTC還原，使菌落顯紅色，便于計數(shù)，同時抑制大片蔓延菌落的形成[4,5]。但在使用過程中應(yīng)嚴(yán)格控制TTC的濃度，否則影響菌落計數(shù)。

　　在菌落總數(shù)和大腸菌群測定計數(shù)時，有時會遇到無法區(qū)分殘?jiān)⒘：途涞那樾巍＿@時應(yīng)仔細(xì)觀察，尋找殘?jiān)c菌落的區(qū)別：一般殘?jiān)螤畈灰?guī)則，而菌落則相對規(guī)則；殘?jiān)伾档?，而菌落則相對明亮。另外還可通過延長培養(yǎng)時間進(jìn)行判斷，因?yàn)槿绻麨榧?xì)菌，通常會繼續(xù)生長。對于菌落總數(shù)測定還可以通過多接種一個平板，傾注瓊脂后將其放到0℃-4℃冰箱中，待計數(shù)時作為對照；或者添加TTC使細(xì)菌染成紅色進(jìn)行計數(shù)。

　　此外，在菌落總數(shù)和大腸菌群計數(shù)時，還可能出現(xiàn)高稀釋倍數(shù)培養(yǎng)皿細(xì)菌數(shù)與低稀釋倍不成10倍關(guān)系，或高稀釋倍數(shù)培養(yǎng)皿細(xì)菌數(shù)高于低稀釋倍數(shù)，這可能是檢驗(yàn)過程操作有誤或者樣品中還含有防腐劑，此時的計數(shù)結(jié)果不應(yīng)作為報告結(jié)果的依據(jù)。

　　培養(yǎng)基的保存

　　在菌落總數(shù)和大腸菌群測定時，所用培養(yǎng)基是影響測定結(jié)果的一個至為關(guān)鍵的因素，所有培養(yǎng)基都應(yīng)該符合GB 4789.28-2013標(biāo)準(zhǔn)要求。一些常用的培養(yǎng)基如平板計數(shù)瓊脂、LST肉湯（月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯）、乳糖膽鹽發(fā)酵管，如果一次不能完全用完，可置于4℃冰箱，一般可保存兩周。平板計數(shù)瓊脂可且只能融化一次使用，過多融化將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；大腸菌群平板法中，VRBA（結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂）應(yīng)在使用前3小時內(nèi)制備，以防受到污染。

　　結(jié)語：

　　食品質(zhì)量安全與人們的健康生活息息相關(guān)，習(xí)近平總書記曾對食品質(zhì)量安全工作作出重要指示，提出要堅(jiān)持“最嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臉?biāo)準(zhǔn)、最嚴(yán)格的監(jiān)管、最嚴(yán)厲的處罰、最嚴(yán)肅的問責(zé)”。作為一名基層食品微生物檢驗(yàn)人員，在食品檢測技術(shù)日益發(fā)展的今天，更應(yīng)該與時俱進(jìn)，深刻掌握檢驗(yàn)的相關(guān)原理以及注意要點(diǎn)。在菌落總數(shù)和大腸菌群時，要做到每一步驟操作精細(xì)準(zhǔn)確，這樣才能保證檢驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為我國食品安全監(jiān)管貢獻(xiàn)出力量。

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