□ 朱曉雯 付金鳳 常州市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心

摘　要：本試驗(yàn)的目的是建立高效液相色譜法測(cè)定羅丹明B的不確定度評(píng)估方法，采用食品中羅丹明B經(jīng)固相萃取、反相色譜柱分離、流動(dòng)相等度洗脫、外標(biāo)法定量的方法，依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》考察了稱量、標(biāo)準(zhǔn)溶液配制、儀器重復(fù)測(cè)量等帶入的不確定度，并對(duì)不確定度的各分量進(jìn)行計(jì)算合成。結(jié)果顯示，當(dāng)食品中羅丹明B的含量為0.0052±1.81×10-4mg/kg時(shí)，在95%的置信區(qū)間下，其擴(kuò)展不確定度為1.81×10-4mg/kg(k=2)。究其原因，測(cè)定過(guò)程中的不確定度主要來(lái)源于對(duì)照品稱量、對(duì)照品溶液制備及樣品定容過(guò)程。因此得出結(jié)論，本方法對(duì)食品中羅丹明B的含量測(cè)定具有一定的參考意義。

關(guān)鍵詞：不確定度 高效液相色譜法 食品 羅丹明B

引言

羅丹明B(Rhodamine B)是一種具有鮮桃紅色的人工合成染料，其在溶液中會(huì)發(fā)出強(qiáng)烈的熒光，常用于實(shí)驗(yàn)室中細(xì)胞熒光染色劑、有色玻璃、特色煙花爆竹等行業(yè)。羅丹明B曾經(jīng)被用作食品添加劑，但經(jīng)實(shí)驗(yàn)證明其存在致癌性后，已被禁止用于食品染色。但是，時(shí)至今日，仍有一些不法商販在各種調(diào)味料的生產(chǎn)中使用羅丹明B以達(dá)到以次充好的目的。

本研究采用高效液相色譜法[1]對(duì)食品中羅丹明B的含量進(jìn)行測(cè)定，并依據(jù)《測(cè)量不確定度評(píng)定與表示》(JJF 1059.1-2012)[2]和《化學(xué)分析中不確定度的評(píng)估指南》[3](CNAS-GL06)對(duì)食品中羅丹明B檢測(cè)的不確定度進(jìn)行測(cè)量和分析，以期為食品中羅丹明B的檢測(cè)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甲醇、乙腈(色譜純)，德國(guó)默克公司;羅丹明B對(duì)照品(批號(hào)510081-201401)，中國(guó)食品藥品檢定研究院;供試樣品為花椒油(批號(hào)：2016.04.08)，廠家A。

1.2 儀器與設(shè)備

島津高效液相色譜儀LC-20A，日本島津公司;METTLER XP105電子天平，瑞士梅特勒-托利多集團(tuán)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 色譜條件

色譜柱：Thermo Syncronis C18(4.6×250mm，5μm);流動(dòng)相：0.1%甲酸水溶液︰乙腈(45︰55);檢測(cè)器：熒光檢測(cè)器，激發(fā)波長(zhǎng)550nm、發(fā)射波長(zhǎng)580nm;流速：1mL/min;柱溫：5℃;進(jìn)樣量：10μL;等度洗脫。

1.3.2 對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取羅丹明B對(duì)照品10mg置于100mL容量瓶中，用甲醇稀釋至刻度，作為標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。用移液管精密吸取0.5mL儲(chǔ)備液至100mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，作為標(biāo)準(zhǔn)中間溶液。用含0.1%甲酸的乙腈水溶液將中間標(biāo)準(zhǔn)溶液稀釋成0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0ng/mL，作為標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

1.3.3 供試品溶液的制備方法

稱取試樣1g(精確到0.01g)置于50mL離心管中，加入10.0mL含0.1%甲酸的甲醇水溶液混勻后于漩渦混勻器上渦旋15min，再于8000r/min離心10min，取3mL提取液層過(guò)0.45μm有機(jī)相濾膜待凈化。將上述提取液1mL移至固相萃取小柱中，加樣前先分別用3mL甲醇與水活化，上樣后依次用3mL0.1%甲酸水溶液、3mL水、3mL甲醇淋洗固相萃取柱。然后，用6mL氨水甲醇溶液洗脫目標(biāo)物，收集流出液，在45℃水浴中氮?dú)獯蹈?，?.5mL0.1%甲酸的乙腈水溶液溶解殘?jiān)ㄟ^(guò)0.22μm濾膜至進(jìn)樣瓶，作為供試品溶液。

1.3.4 測(cè)定方法

分別準(zhǔn)確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液和試樣溶液10μL進(jìn)樣，依據(jù)上述色譜條件，以保留時(shí)間定性，用外標(biāo)法計(jì)算試樣中羅丹明B的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)量數(shù)學(xué)模型的建立

樣品中羅丹明B的含量按照公式計(jì)算：

。

式中：X為羅丹明B的含量，mg/kg;c為試樣中羅丹明B峰面積對(duì)應(yīng)的濃度，ng/mL;V為試樣定容體積，mL;m為稱樣量，g;f為稀釋因子。

2.2 各分量不確定度的來(lái)源

①標(biāo)準(zhǔn)溶液引入的不確定度：a.標(biāo)準(zhǔn)品稱量引入的不確定度u(Wr),b.標(biāo)準(zhǔn)品稀釋過(guò)程引入的不確定度u(Vr);②供試品溶液引入的不確定度：a.樣品稱量引入的不確定度u(Wx),b.樣品稀釋過(guò)程引入的不確定度u(Vx);③高效液相色譜儀引入的不確定度u(y);④樣品加標(biāo)回收率重復(fù)性實(shí)驗(yàn)引入的不確定度u(FRec)。

2.3 不確定度分量的評(píng)定

2.3.1 樣品制備過(guò)程引入的不確定度

2.3.1.1 樣品稱量過(guò)程

根據(jù)天平檢定證書(shū)，50g內(nèi)所使用天平的最大允差為±0.0005g，置信區(qū)間為95%。稱量2次，按正態(tài)分布，取，則。樣品稱量5次，分別為1.0213、1.0225、1.0156、1.0278、1.0106g，對(duì)應(yīng)引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度分別為：6.92×10-4、6.91×10-4、6.96×10-4、6.88×10-4、7.00×10-4。

則樣品稱量引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度：

2.3.1.2 樣品制備稀釋過(guò)程中引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

玻璃儀器在20℃校準(zhǔn)，而實(shí)驗(yàn)室溫度在(20±5)℃范圍內(nèi)波動(dòng)，水的膨脹系數(shù)為2.1×10-4/℃，按均勻分布計(jì)算，，溶液溫度與校正時(shí)溫度差引起的水體積不確定度為。

由于樣品制備過(guò)程中使用了1、10mL移液管(均為A級(jí))，因此按照《常用玻璃儀器檢定規(guī)程》(JJG 196-2006)[4]的要求，均有相應(yīng)的允許偏差。按照矩形分布考慮，，由此估算本實(shí)驗(yàn)中涉及到的玻璃器皿的相對(duì)不確定度分量分別為4.09×10-3、1.30×10-3。

樣品制備過(guò)程中稀釋因子引入的合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.2 對(duì)照品溶液制備過(guò)程引入的不確定度

2.3.2.1 對(duì)照品稱量過(guò)程
根據(jù)天平檢定證書(shū)，十萬(wàn)分之一天平的最大稱量誤差為±0.1mg。稱量2次，按正態(tài)分布，取，則

，稱取10mg羅丹明B由天平引起的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為:

2.3.2.2 對(duì)照品制備過(guò)程中稀釋因子

對(duì)照品溶液制備過(guò)程中使用了10、25、50、100mL容量瓶及1mL移液管，均為A級(jí)。對(duì)照品制備稀釋過(guò)程中引入與涉及到的玻璃器皿的相對(duì)不確定度分量分別為1.30×10-3、6.06×10-4、8.37×10-4、5.80×10-3、4.09×10-3，合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：

2.3.3 高效液相色譜儀引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

本研究采用島津高效液相色譜儀LC-20A進(jìn)行測(cè)定，校準(zhǔn)證書(shū)上儀器的定量重復(fù)性誤差為1.1%(n=5)，則液相色譜儀的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為： 。

2.3.4 樣品溶液制備過(guò)程中由重復(fù)性引起的不確定度及由樣品取樣量引入的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

樣品重復(fù)測(cè)定6次，回收率實(shí)驗(yàn)中的回收率分別為89.05%、87.27%、89.56%、86.41%、90.17%、88.26%，平均回收率為88.4%，標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.4%，統(tǒng)計(jì)結(jié)果為正態(tài)分布，置信水平95%，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。式中：s為標(biāo)準(zhǔn)偏差;FRec為平均回收率;n為回收率實(shí)驗(yàn)6次。

2.4 合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度

綜合上述不確定度分量，則合成相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)不確定度為：。

通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)得平均加樣含量為0.0052mg/kg，合成標(biāo)準(zhǔn)不確定度為0.0052×0.0174=9.05×10-5mg/kg。

2.5 擴(kuò)展不確定度

在95%置信區(qū)間下，取包含因子k=2，則擴(kuò)展不確定度為9.05×10-5×2=1.81×10-4mg/kg，以樣品平均含量測(cè)得0.0052mg/kg，故本次實(shí)驗(yàn)結(jié)果的不確定度為0.0052±1.81×10-4mg/kg(k=2)。

3 結(jié)論

本研究對(duì)食品中添加羅丹明B含量檢測(cè)的不確定度來(lái)源進(jìn)行了較為全面的分析，從研究結(jié)果可知，其主要來(lái)源為對(duì)照品稱量、稀釋過(guò)程及供試品稀釋過(guò)程引入的不確定度。因此，在實(shí)際檢測(cè)工作中，天平的定期檢定與維護(hù)保養(yǎng)、玻璃量器的校準(zhǔn)，以及實(shí)驗(yàn)室溫濕度[5]的控制對(duì)進(jìn)一步提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

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[5] 朱曉雯，郭芯岐.高效液相色譜法測(cè)定減肥類保健食品中酚酞含量的不確定度評(píng)定[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)，2018，9(15):3954-3957.