□ 王海琪 宮三潤(rùn)怡 潘文(通信作者) 集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院

摘　要：本文的研究對(duì)象為苦瓜提取物的抑菌活性并求出其抑菌比，通過(guò)對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以及結(jié)合實(shí)驗(yàn)相關(guān)數(shù)據(jù)探討了提取物的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦瓜提取物能夠?qū)Σ糠旨?xì)菌起到明顯的抑制效果，金黃色葡萄球菌與枯草芽孢桿菌為其中最具代表性的細(xì)菌。大量提取單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，若苦瓜粉末處于乙醇濃度為70%、料液比為1∶30，并保持60℃水浴回流4h后，得到的苦瓜提取物的抑菌效果最好。故得出結(jié)論，苦瓜提取物的穩(wěn)定性較強(qiáng)，高溫下處理的活性損失小，耐紫外線，抑菌活性時(shí)間長(zhǎng)達(dá)一個(gè)月。

關(guān)鍵詞：苦瓜提取物 穩(wěn)定性 抑制作用 微生物

苦瓜是我國(guó)南北方地區(qū)均普遍栽培的可食用蔬菜，口感以甘苦為主，但營(yíng)養(yǎng)價(jià)值極高。例如，果肉部分不僅富含維生素，還含有對(duì)人體有益的微量元素，食用價(jià)值在各類果蔬中當(dāng)屬翹楚?，F(xiàn)代實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，苦瓜還具有一定的藥用價(jià)值，主要體現(xiàn)在降血糖、抗癌、抗菌、抗過(guò)濾性病原體、提高免疫力，以及抗氧化、抗衰老等方面[1，2]?；诖耍緦?shí)驗(yàn)探討苦瓜提取物在抑菌方面的實(shí)驗(yàn)研究，以及苦瓜提取物作為食源性防腐劑的可能性和應(yīng)用潛力。實(shí)驗(yàn)對(duì)象選擇罐頭、農(nóng)產(chǎn)品、飲料等代表性食品中常見的酵母菌、霉菌、細(xì)菌等腐敗菌株[3]，通過(guò)對(duì)照試驗(yàn)來(lái)確定苦瓜提取物的抑菌譜，然后篩選出對(duì)苦瓜提取物表現(xiàn)較為敏感的菌株，并將其作為試驗(yàn)的指示菌，進(jìn)而探討苦瓜對(duì)常見細(xì)菌的抑制作用。

1 材料與方法

1 材料

1.1.1 試驗(yàn)材料

選取適量于菜市場(chǎng)購(gòu)買的新鮮苦瓜，洗凈后切成大小均勻的薄片，于50℃條件下烘干，然后對(duì)其進(jìn)行粉碎、過(guò)篩、干燥與保存。

1.1.2 供試菌種

啤酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、大腸桿菌(Escherichia coli)、枯草芽孢桿菌(Bacillus sabtilis)、金黃色葡萄球菌(Staphy lococcus aureus)、桔青霉(Penicillium citrinum)、黑曲霉(Aspergillus niger)，均來(lái)源于集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 苦瓜提取物的制備

準(zhǔn)備適量苦瓜干粉，按照1∶30的料液比置于70%的乙醇中，然后于60℃水浴回流持續(xù)提取4h，取上清，得到苦瓜提取物。

1.2.2 菌種的活化

參照王貽蓮等[4]的方法，在無(wú)菌試驗(yàn)臺(tái)中采用平板劃線法于培養(yǎng)基中移接相應(yīng)的菌株。菌種活化的過(guò)程需注意分別活化，并將其放入對(duì)應(yīng)的培養(yǎng)箱中。細(xì)菌菌種置于培養(yǎng)箱，需保持在37℃恒溫狀態(tài)下培養(yǎng)24h;酵母菌和霉菌菌種置于培養(yǎng)箱，則需保持在28℃恒溫狀態(tài)下培養(yǎng)48h。

1.2.3 供試菌株懸浮液的制備

提取已完成活化的菌種，在經(jīng)過(guò)滅菌處理的三角瓶中加入適量無(wú)菌水，參考孟曉等[5]的研究來(lái)制備具有最低抑菌濃度的菌懸液。

1.2.4 苦瓜抑菌譜的測(cè)定

采用濾紙片法，以20mg/mL的山梨酸鉀溶液作為對(duì)比，選擇濃度為70%的乙醇作為空白對(duì)照，每種設(shè)3個(gè)重復(fù)，然后以無(wú)水乙醇作為對(duì)照，測(cè)定抑菌圈直徑，取其平均值。

1.2.5 測(cè)定不同預(yù)處理及不同溶媒條件對(duì)苦瓜抑菌活性的影響

試驗(yàn)原材料需要通過(guò)4種不同的處理方式來(lái)完成相應(yīng)的預(yù)處理，預(yù)處理所獲得的試驗(yàn)原材料分別為鮮汁、切片、干粉，以及微波處理后的切片。試驗(yàn)開始之前需測(cè)定待處理樣品的含水量，然后計(jì)算苦瓜干物質(zhì)含量，不同樣品均按照測(cè)定的干物質(zhì)含量進(jìn)行計(jì)算;苦瓜粉末處于乙醇濃度為70%、料液比為1∶30，保持60℃水浴回流4h，然后過(guò)濾，得上清，即為樣品液。利用濾紙片法計(jì)算抑菌直徑，取其平均值[6]。另外，分別準(zhǔn)備4份相同分量的苦瓜干粉，按照1∶30的比例對(duì)應(yīng)添加水、70%的乙醇、乙酸乙酯、正己烷這4種溶媒，并于60℃水浴回流4h，提取，過(guò)濾得上清，即為樣品液。同樣利用濾紙片法計(jì)算抑菌直徑，取其平均值。

1.2.6苦瓜提取工藝的單因素試驗(yàn)[6]

等質(zhì)量稱取苦瓜干粉4份，將樣品置于不同提取時(shí)間、提取溫度、乙醇濃度和料液比條件下進(jìn)行試驗(yàn)，通過(guò)濾紙片法分別完成抑菌直徑的測(cè)定，最終選用其平均值。

1.2.7 紫外線、環(huán)境溫度及存放時(shí)間對(duì)苦瓜提取物抑菌活性的影響[7，8]

將苦瓜提取物分別置于不同的環(huán)境溫度、紫外光及不同存放時(shí)間條件下，指示菌選擇枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌，采用抑菌圈直徑法測(cè)定處理前后樣品的抑菌效力。為保證試驗(yàn)結(jié)果的可靠性，將該試驗(yàn)過(guò)程重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 苦瓜提取物對(duì)不同受試菌的抑制效果

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，苦瓜提取物對(duì)所選試驗(yàn)菌株均具有良好的抑制效果，尤其是對(duì)枯草芽孢桿菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用十分顯著，但是對(duì)真菌幾乎沒(méi)有抑制作用;山梨酸鉀的作用恰好同提取物相反，其對(duì)真菌菌株的抑制作用較強(qiáng)，而對(duì)細(xì)菌菌株的抑制作用較弱。因此，以下實(shí)驗(yàn)主要探討不同工藝條件下苦瓜提取物對(duì)細(xì)菌抑制作用的比較。

2.2 預(yù)處理、溶媒對(duì)苦瓜抑菌活性的影響

通過(guò)不同預(yù)處理的苦瓜提取物的抑菌活性有所差異，新鮮苦瓜汁的抑菌活性遠(yuǎn)不及干粉、切片、微波處理后的切片——后3種預(yù)處理的苦瓜提取物抑菌活性非常強(qiáng)，將其按照從強(qiáng)到弱的順序進(jìn)行排列：苦瓜干粉>微波處理后的切片>苦瓜切片。由此說(shuō)明，對(duì)實(shí)驗(yàn)材料(新鮮苦瓜)采取不同的預(yù)處理措施會(huì)導(dǎo)致其抑菌活性有所差別。此外，溶劑浸提的苦瓜提取物含量也有所差異，即不同溶劑對(duì)于試驗(yàn)結(jié)果具有一定的影響。試驗(yàn)選擇的4種溶媒對(duì)于提取物按照影響力由強(qiáng)到弱進(jìn)行排列，依次為70%的乙醇、乙酸乙酯、正己烷、水。除此之外，溶劑的極性和提取物的抑菌能力之間呈現(xiàn)正相關(guān)關(guān)系。根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可知，提取物中具有抑菌作用的成分為極性物質(zhì)。

2.3 苦瓜提取工藝的單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

植物天然抑菌成分常用的提取工藝為固液浸提法，在苦瓜活性成分提取過(guò)程中，影響較大的幾個(gè)因素主要有溶劑種類的差異、環(huán)境溫度的不同、提取時(shí)間和料液比的區(qū)別等[7]。因此，試驗(yàn)期間通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)法來(lái)完成對(duì)不同影響因素的分析。

由圖1可知，乙醇濃度和抑菌性能之間表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，如果乙醇濃度持續(xù)增加至70%，則提取物的抑菌活性有所下降;如其他條件不變，乙醇濃度為65%時(shí)的苦瓜提取物具有最佳的抑菌效果。

由圖2可知，溫度和抑菌性能之間表現(xiàn)為正相關(guān)關(guān)系，如果溫度持續(xù)升高超過(guò)60℃，則抑菌活性將會(huì)下降。因此，如其他條件不變，溫度為60℃時(shí)的苦瓜提取物具有最佳的抑菌效果。

由圖3可知，提取時(shí)間同抑菌活性之間呈正相關(guān)關(guān)系，但當(dāng)提取時(shí)間超過(guò)4h后，苦瓜提取物的抑菌性能將會(huì)不斷下降。因此得出結(jié)論，如其他條件不變，提取時(shí)間為4h的苦瓜提取物具有最佳的抑菌效果。

由圖4可知，料液比和抑菌性能之間表現(xiàn)為明顯的正相關(guān)關(guān)系，如料液比持續(xù)增加超過(guò)1∶30，則苦瓜提取物的抑菌活性將會(huì)顯著降低。由此可知，如其他條件不變，料液比為1∶30時(shí)的苦瓜提取物具有最佳的抑菌效果。

2.4 環(huán)境溫度、紫外線及存放時(shí)間對(duì)苦瓜提取物抑菌活性的影響

在苦瓜抑菌活性物質(zhì)提取條件的基礎(chǔ)上研究苦瓜提取物的穩(wěn)定性，探討其抑菌活性與總抗氧化能力的相關(guān)性[10]。

由圖5可以看出，苦瓜提取物經(jīng)過(guò)不同溫度處理后其抑菌能力仍保持在較高水平，在超過(guò)80℃之后，活性有所下降，但影響不大，表明苦瓜提取物的抑菌活性物質(zhì)具有較好的熱穩(wěn)定性[11]。

圖6表明，隨著紫外線條件下存放時(shí)間的變化，提取物抑菌性能未發(fā)生明顯變化。因此得出結(jié)論，苦瓜提取物的抑菌活性物質(zhì)在紫外光照射下穩(wěn)定性極強(qiáng)。

圖7表明，苦瓜提取物能在1個(gè)月之內(nèi)保持較高的活性。

綜上所述，本次實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)苦瓜提取物對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制程度高于革蘭氏陰性菌，對(duì)霉菌和酵母菌的抑制作用較弱，而山梨酸鉀的作用恰好同苦瓜提取物所得到的結(jié)論相反。因此，可考慮基于本實(shí)驗(yàn)來(lái)減少化學(xué)合成的食品添加劑含量，即進(jìn)一步探索山梨酸鉀和苦瓜提取物按最合適的比例復(fù)配以全面提高抑菌效力。與此同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)再次驗(yàn)證了植物提取物對(duì)霉菌和酵母菌所產(chǎn)生的抑制作用非常微弱，由此推測(cè)，降低有效活性成分對(duì)霉菌和酵母菌的抑制效果的可能是植物提取物中含有較多糖類、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)。

3 結(jié)論與討論

對(duì)細(xì)菌而言，苦瓜提取物的抑制作用非常顯著，對(duì)枯草芽孢桿菌與金黃色葡萄球菌的抑制效果尤為出眾，而對(duì)霉菌和酵母菌抑制作用極其微弱;山梨酸鉀的抑菌作用結(jié)論反之。各種預(yù)處理方式中，苦瓜干粉的抑菌活性遠(yuǎn)高于其他預(yù)處理方式，切片次之。同時(shí)，發(fā)現(xiàn)苦瓜中具有抑菌活性的物質(zhì)以中等極性為主，通過(guò)嚴(yán)謹(jǐn)?shù)膯我蛩卦囼?yàn)后確定了苦瓜提取物在料液比(W∶V)1∶30、提取溫度60℃、乙醇濃度70%(V/V)、水浴回流4h的特定條件下可制備出抑菌效果最佳的提取物質(zhì)。此外，苦瓜提取物的熱穩(wěn)定性較強(qiáng)，在100℃以下都能有效保持較高的抑菌活性;對(duì)紫外光照射穩(wěn)定，在1個(gè)月內(nèi)仍能保持其抑菌活性。

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基金項(xiàng)目：福建省教育廳中青年教師教育科研項(xiàng)目(JT180289)，李尚大集美大學(xué)學(xué)科建設(shè)基金(ZC2018035)。