一種基于ATP熒光反應(yīng)的潔凈度檢測系統(tǒng)的開發(fā)與驗證
□ 柳江山 陶文靖 曲連海 周琦 北京美正生物科技有限公司
□ 張細(xì)玲 陳琳 達(dá)利食品集團(tuán)有限公司
摘 要:本文旨在建立一種基于ATP熒光反應(yīng)的潔凈度檢測系統(tǒng),并對該系統(tǒng)的主要性能指標(biāo)進(jìn)行驗證,包括線性、重復(fù)性、檢出限及衰減率等,并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,本拭子對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限為1.77×10-15mol/L,線性良好;對菌液的檢出結(jié)果為:大腸埃希氏菌檢出限2000CFU、金黃色葡萄球菌檢出限800CFU、酵母菌檢出限10CFU,均線性良好。該系統(tǒng)重復(fù)性良好,在高濃度ATP下,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8%;在低濃度ATP下,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為13%,均小于15%;在6min內(nèi),熒光衰減率無明顯變化。故得出結(jié)論,本拭子的靈敏度、線性、重復(fù)性和衰減率指標(biāo)均較好。
關(guān)鍵詞:三磷酸腺苷 ATP熒光 潔凈度 驗證
隨著目前國內(nèi)對于食品安全的重視程度越來越高,食品微生物檢測技術(shù)也在不斷革新。傳統(tǒng)的食品微生物檢測方法一般為平板計數(shù)法,但該方法步驟繁瑣,包括培養(yǎng)基制備、滅菌、樣品均質(zhì)與稀釋、制備平板、恒溫培養(yǎng)等多項操作,耗時至少2天,費時費力,已無法滿足食品企業(yè)對于生產(chǎn)環(huán)境監(jiān)測和質(zhì)量控制的需求。此時,ATP熒光技術(shù)作為一種新的檢測技術(shù)提供了新的設(shè)計思路——通過對細(xì)胞中的ATP進(jìn)行檢測,能夠在短時間內(nèi)估算被測物體上殘留的微生物大致數(shù)量,從而實現(xiàn)對食品企業(yè)生產(chǎn)環(huán)境的快速檢測,且能快速報告結(jié)果,在大大縮短檢測時間的同時節(jié)省了人力與物力。
ATP又稱腺嘌呤核苷三磷酸(簡稱“三磷酸腺苷”),是一種不穩(wěn)定的高能化合物,由1分子腺嘌呤、1分子核糖和3分子磷酸基團(tuán)組成。ATP是生物體內(nèi)最直接的能量來源,其在細(xì)胞中能通過與ADP的相互轉(zhuǎn)化實現(xiàn)貯能和放能,從而保證細(xì)胞各項生命活動的能量供應(yīng)。ATP生物發(fā)光法是產(chǎn)生于20世紀(jì)70年代中期的一種ATP檢測方法,其檢測原理為在有氧條件下,熒光素酶催化熒光素和ATP之間發(fā)生氧化反應(yīng)生成氧化熒光素并發(fā)出熒光。因此,熒光強(qiáng)度與ATP含量呈正比,即待測樣品中微生物數(shù)量越多,ATP的含量越高,發(fā)出的熒光越強(qiáng)[1,2]。手持式ATP熒光檢測儀就是基于ATP生物發(fā)光的原理,利用專門研制的熒光檢測儀和ATP涂抹拭子來捕捉和檢測發(fā)光值,以及測定樣本表面微生物污染程度的快速檢測設(shè)備,具有操作簡單、快速、適用范圍廣、攜帶方便、功耗低、對操作人員的專業(yè)技術(shù)水平要求低等優(yōu)點[3-5]。本研究對潔凈度檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測效果的驗證,分別從檢測靈敏度、線性、重復(fù)性和衰減率這4個方面進(jìn)行。
1 材料
1.1 儀器與試劑
PureTrustTM智能熒光檢測儀,北京美正生物科技有限公司;ATP表面涂抹拭子,北京美正生物科技有限公司;ATP標(biāo)準(zhǔn)品(相對分子質(zhì)量為507.18),SIGMA;無菌水,北京美正生物科技有限公司。
1.2 菌株
大腸埃希氏菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(ATCC 6538)、酵母菌(ATCC 10231)。
1.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制
ATP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液配制:準(zhǔn)確稱取一定量ATP標(biāo)準(zhǔn)品于100mL容量瓶中,用無菌水溶解并定容,配制成濃度為1.77×10-8mol/L的腺苷-5'-三磷酸標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。用移液槍移取0.1mL ATP標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液,加入0.9mL無菌超純水,制成濃度為1.77×10-9mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液,然后逐級稀釋成濃度為1.77×10-10、1.77×10-11、1.77×10-12mol/L……1.77×10-16mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液,置于-20℃冷凍,備用。
2 檢測方法
為確保檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性和可靠性,實驗過程需注意以下幾個方面。①實驗過程中,檢測人員必須佩帶手套和口罩,以此避免檢測人員自身攜帶的ATP對實驗結(jié)果造成影響;②拭子需冷藏放置,在使用之前需恢復(fù)至室溫;③取拭子時不能觸碰拭子頭或柄,以免造成污染;④振搖拭子時不能上下?lián)u動;⑤在測量過程中要保持熒光儀垂直。ATP熒光檢測儀以相對光單位(relative light units,RLU)數(shù)值顯示結(jié)果,RLU值與檢測樣本中的ATP含量呈正比。
2.1 靈敏度及線性
2.1.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)品檢測靈敏度
取濃度為1.77×10-10~1.77×10-15mol/L梯度的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液,從ATP表面涂抹拭子中取出棉簽,用移液槍準(zhǔn)確移取20μL ATP標(biāo)準(zhǔn)工作溶液滴于棉簽頭上,然后將棉簽插回拭子管內(nèi)并按下使其與底液接觸,將檢測管左右搖晃5~10s,充分混勻后,插入ATP檢測儀,等待30s后開始檢測。
2.1.2 菌體檢測靈敏度
在對菌體進(jìn)行檢測時,選取較為常見的革蘭氏陽性細(xì)菌(大腸埃希氏菌)、革蘭氏陰性細(xì)菌(金黃色葡萄球菌)和真菌(酵母菌)這3種,檢測本產(chǎn)品對不同構(gòu)造菌體的裂解及檢測能力。
2.1.2.1 大腸埃希氏菌
取濃度為1×108CFU/mL ATCC 25922新鮮菌液,稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度,從檢測管中取出棉簽,用移液槍準(zhǔn)確移取20μL菌液滴于棉簽頭上,等待30s,然后將棉簽插回檢測管內(nèi)并按下使其與底液接觸,將檢測管左右搖晃5~10s,充分混勻后,插入ATP熒光檢測儀,等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進(jìn)行線性分析,根據(jù)R2判斷其線性是否良好。
2.1.2.2 金黃色葡萄球菌
取濃度為4×108CFU/mL ATCC 6538新鮮菌液,稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度。從檢測管中取出棉簽,用移液槍準(zhǔn)確移取20μL菌液滴于棉簽頭上,等待30s,然后將棉簽插回檢測管內(nèi)并按下使其與底液接觸,將檢測管左右搖晃5~10s,充分混勻后,插入ATP檢測儀,等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進(jìn)行線性分析,根據(jù)R2判斷其線性是否良好。
2.1.2.3 酵母菌
取5×106CFU/mL ATCC 10231新鮮菌液,稀釋至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6梯度,從檢測管中取出棉簽,用移液槍準(zhǔn)確移取20μL菌液滴于棉簽頭上,等待30s,然后將棉簽插回檢測管內(nèi)并按下使其與底液接觸,將檢測管左右搖晃5~10s,充分混勻后,插入ATP檢測儀,等待30s后開始檢測。將得到的熒光值與ATP濃度和菌液濃度進(jìn)行線性分析,根據(jù)R2判斷其線性是否良好。
2.2 重復(fù)性
用移液槍準(zhǔn)確移取20μL不同濃度的ATP標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液(1.77x10-6mol/L濃度梯度和1.77x10-8mol/L濃度梯度)滴于棉簽頭上,然后將棉簽插回拭子管內(nèi)并按下使其與底液接觸,左右搖晃5~10s,充分混勻后,將拭子插入ATP檢測儀,等待30s后開始檢測。重復(fù)測試10次,計算10次結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD),相對標(biāo)準(zhǔn)偏差應(yīng)小于15%。
2.3 衰減率
測定儀器在5min內(nèi)的熒光值衰減率。選擇一個較高濃度ATP溶液(1.77x10-13mol/L)和一個較低濃度ATP溶液(1.77x10-15mol/L),各吸取20μL滴加至拭子棉簽上,測定反應(yīng)發(fā)生后5min內(nèi)的熒光衰減率,每隔一分鐘測定一次熒光值,衰減率應(yīng)不超過25%。
3 結(jié)果與分析
3.1靈敏度
3.1.1 ATP標(biāo)準(zhǔn)品檢測靈敏度
本試驗選擇1.77×10-10~1.77×10-16mol/L的ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行梯度實驗,測得的不同濃度ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液檢測值如表1。
由表1可以看出,在1.77×10-10~1.77×10-16mol/L濃度范圍內(nèi),儀器測得的熒光值隨ATP濃度變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異,檢測值隨ATP濃度降低而減小。由圖1可知,在1.77×10-10~1.77×10-16mol/L濃度范圍內(nèi),儀器所測得的熒光值不僅呈現(xiàn)出明顯的梯度差異,而且有較好的線性關(guān)系,線性方程為y=0.9589x+18.442(R²=0.9961)。所以,本系統(tǒng)可準(zhǔn)確檢測濃度在1.77×10-10~1.77×10-16mol/L范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)ATP樣品,最低檢測限為1.77×10-15mol/L。
3.1.2 菌體檢測靈敏度及線性
3.1.2.1 大腸埃希氏菌
大腸埃希氏菌是革蘭氏陰性菌,本系統(tǒng)對大腸埃希氏菌的檢測結(jié)果如下:
由表2可以看出,在2×106至2000CFU范圍內(nèi),儀器測得的熒光值隨菌液量變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異,檢測值隨菌量降低而減小。圖2表明,在一定范圍內(nèi),儀器測得的熒光值不僅有明顯的梯度差異,且有良好的線性關(guān)系,線性方程為y=1.0062x-0.9009(R²=0.9719)。所以,本拭子可以準(zhǔn)確檢測CFU在2×106至2000范圍內(nèi)的大腸桿菌,最低檢測限為2000CFU。
3.1.2.2 金黃色葡萄球菌
金黃色葡萄球菌是革蘭氏陽性菌,本系統(tǒng)對金黃色葡萄球菌的檢測結(jié)果如表3。
由表3可以看出,在8×106至800CFU范圍內(nèi),儀器測得的熒光值隨菌液量變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異,檢測值隨菌量降低而減小。圖3表明,在一定范圍內(nèi),本儀器測得的熒光值與菌液濃度的線性關(guān)系較好,線性方程為y=1.0735x-2.079(R²=0.9969)。所以,本拭子可以準(zhǔn)確檢測CFU在8×106至800范圍內(nèi)的金黃色葡萄球菌,最低檢測限為800CFU。
3.1.2.3 酵母菌
酵母菌屬于真菌的一種,本系統(tǒng)對酵母菌的檢測結(jié)果如表4。
由表4可以看出,在105至10CFU范圍內(nèi),本系統(tǒng)測得的熒光值隨菌液量變化呈現(xiàn)明顯的梯度差異,檢測值隨菌量降低而減小。圖4表明,在一定范圍內(nèi),本儀器測得的熒光值與酵母菌液濃度的線性關(guān)系較好,線性方程為y=0.9046x+1.8542(R²=0.9916)。所以,本拭子可以準(zhǔn)確檢測CFU在105至10CFU范圍內(nèi)的酵母菌,最低檢測限為10CFU。
3.2 重復(fù)性驗證結(jié)果
選取ATP 1.77×10-13mol/L梯度和ATP 1.77×10-15mol/L梯度的標(biāo)準(zhǔn)溶液,測試拭子重復(fù)性,檢測結(jié)果如表5。
由表5可以看出,在較高濃度ATP(1.77×10-13mol/L)情況下,檢測10次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為8%;在較低濃度ATP(1.77×10-15mol/L)情況下,檢測10次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為13%,高濃度和低濃度ATP條件下的檢測重復(fù)性均小于15%。所以,本系統(tǒng)具有良好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。
3.3 衰減率
使用ATP熒光法檢測潔凈度時,衰減率是一個重要指標(biāo)——在ATP熒光反應(yīng)中所生成的熒光容易發(fā)生降解,導(dǎo)致檢測的時效性和穩(wěn)定性都受到較大影響。本研究對待測拭子進(jìn)行了衰減率檢測,結(jié)果詳見表6。
由表6可知,濃度為1.77×10-13mol/L的ATP溶液在檢測第6min時,熒光值相比較最高熒光值是92%;濃度為1.77×10-15mol/L的ATP溶液在檢測第6min時,熒光值相比較最高熒光值是106%。兩次試驗的衰減率均遠(yuǎn)小于25%,說明本系統(tǒng)具有良好的抗衰減能力,滿足ATP檢測要求。
4 討論
本研究對一種基于ATP熒光反應(yīng)的潔凈度檢測系統(tǒng)的靈敏度、線性、重復(fù)性和衰減率進(jìn)行了驗證,且驗證結(jié)果良好;該系統(tǒng)對ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液的檢出限為1.77×10-15mol/L,線性良好。該系統(tǒng)對菌液的檢出結(jié)果為:大腸埃希氏菌檢出限2000CFU、金黃色葡萄球菌檢出限800CFU、酵母菌檢出限10CFU,均線性良好。同時,這一系統(tǒng)的重復(fù)性良好,在高濃度ATP下,重復(fù)檢測10次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為8%;低濃度ATP下,重復(fù)檢測10次,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為13%,均小于15%,滿足要求。此外,在6min內(nèi),熒光衰減率沒有明顯變化。以上結(jié)果表明,該潔凈度檢測系統(tǒng)的基本性能可滿足環(huán)境潔凈度檢測的要求。
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