董慧明

(遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧沈陽(yáng) 110036)

摘 要：為了提高微生物實(shí)驗(yàn)室大腸菌群的檢測(cè)能力，遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心于2019年參加了乳粉中大腸菌群的計(jì)數(shù)(定量)檢測(cè)能力驗(yàn)證，依據(jù)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)進(jìn)行檢驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用3M Petrifilm CC測(cè)試片作為對(duì)照手段。結(jié)果表明，樣品CODE TF02240028結(jié)果報(bào)告為3 100 CFU/g、CODE TF02240028結(jié)果報(bào)告為4 200 CFU/g，反饋結(jié)果滿意，值均<2。

關(guān)鍵詞：大腸菌群;能力驗(yàn)證;平板計(jì)數(shù);3M測(cè)試片

大腸菌群是一群能發(fā)酵乳糖、產(chǎn)酸產(chǎn)氣、無(wú)芽孢需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性桿菌。大腸菌群與大腸桿菌相似，可以其檢出情況來(lái)判斷食品是否受到了人及溫血?jiǎng)游锛S便的污染，作為食品、飲用水等衛(wèi)生指標(biāo)菌[1]。大腸菌群定量檢測(cè)為食品微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目，其檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性能判定實(shí)驗(yàn)室基本能力水平是否達(dá)到要求。食品中大腸菌群的檢測(cè)有著重要意義，可以掌握食品的衛(wèi)生狀況，有利于控制腸道病的爆發(fā)傳播，及時(shí)做出有效的預(yù)防措施[2]。

能力驗(yàn)證活動(dòng)是利用實(shí)驗(yàn)室間的比對(duì)，按照預(yù)先制定的準(zhǔn)則評(píng)價(jià)參加者的能力[3]。為提高實(shí)驗(yàn)室食品微生物檢測(cè)能力，確保出具的檢驗(yàn)報(bào)告的準(zhǔn)確性和科學(xué)性，同時(shí)完成實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和完善實(shí)驗(yàn)室管理制度，本實(shí)驗(yàn)室報(bào)名參加了中國(guó)食品藥品檢定研究院乳粉中大腸菌群的計(jì)數(shù)(定量)能力驗(yàn)證。本實(shí)驗(yàn)依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)[4]的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)應(yīng)用3M Petrifilm CC測(cè)試片作為對(duì)照手段。

1 材料與方法

1.1 樣品

本實(shí)驗(yàn)室收到2件待測(cè)樣品，每件樣品由1個(gè)菌球及相應(yīng)奶粉組成，編碼分別為CODE TF02240028、CODE TF02240125。檢測(cè)時(shí)每個(gè)相同編碼的大腸菌群樣品和奶粉基質(zhì)作為1件樣品進(jìn)行檢測(cè)。以無(wú)菌操作打開(kāi)樣品的西林瓶，將西林瓶?jī)?nèi)小球加入到225 mL 0.85%生理鹽水中，充分溶解;然后再將與西林瓶相同編碼的奶粉樣品加入到上述生理鹽水中，充分均質(zhì)混勻。依此方法，分別對(duì)2件樣品進(jìn)行處理，制成1∶10的樣品勻液。

1.2 儀器與試劑

電熱恒溫培養(yǎng)箱(德國(guó)Binder公司);A2型生物安全柜(美國(guó)NUAIRE公司);生物顯微鏡(日本Olympus公司);電子天平(瑞士梅特勒-托利多公司);高壓滅菌鍋(日本Tomy公司);均質(zhì)器(法國(guó)梅里埃公司)。

煌綠乳糖膽鹽(brilliant green lactose bile，BGLB)肉湯、結(jié)晶紫中性紅膽鹽瓊脂(Violet Red Agar，VRBA)、0.85%無(wú)菌生理鹽水，均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限公司;Petrifilm CC大腸菌群測(cè)試紙片(美國(guó)3M公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

依據(jù)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù)》(GB 4789.3—2016)[4]的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。同時(shí)，用3M大腸菌群測(cè)試紙片法作為對(duì)照手段進(jìn)行實(shí)驗(yàn), 每個(gè)稀釋度做兩平行，每片接種量為1 mL，36 ℃培養(yǎng)24 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)計(jì)數(shù)

在VRBA平板上選取菌落在15～150 CFU的平板，分別計(jì)數(shù)平板上出現(xiàn)的典型和可疑菌落，典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環(huán)，菌落直徑為0.5 mm，或更大[4]。大腸菌群菌落在3M大腸菌群測(cè)試片上生長(zhǎng)產(chǎn)酸使培養(yǎng)基顏色變紅變深，目標(biāo)菌落為紅色菌落并且周圍有氣泡產(chǎn)生，計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表1。

2.2 確證實(shí)驗(yàn)

從10-2稀釋度的VRBA平板上挑取10個(gè)典型和可疑菌落(不同類型)，用無(wú)菌接種針取挑取菌落的菌體分別接種于BGLB肉湯管中，36 ℃培養(yǎng)24～48 h，觀察產(chǎn)氣情況，凡BGLB肉湯管產(chǎn)氣，即可報(bào)告為大腸菌群陽(yáng)性(+)[4]，需要注意的是如果接種前BGLB導(dǎo)管內(nèi)有氣泡，應(yīng)該先排除以免影響結(jié)果。兩個(gè)樣品選取的所有典型和可疑菌落均為大腸菌群，見(jiàn)表2。

2.3 大腸菌群平板計(jì)數(shù)的報(bào)告

經(jīng)最后證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性的試管比例乘以相應(yīng)稀釋度VRBA平板計(jì)數(shù)菌落數(shù)，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品中大腸菌群結(jié)果報(bào)告數(shù)，單位為CFU/g。樣品編號(hào)CODE TF02240028結(jié)果報(bào)告為3 100 CFU/g，樣品編號(hào)CODE TF02240028結(jié)果報(bào)告為4 200 CFU/g。

2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果反饋

經(jīng)能力驗(yàn)證組織機(jī)構(gòu)反饋，本實(shí)驗(yàn)室CODE TF02240028大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果為3.491，指定值為3.732，值為1.16;CODE TF02240125大腸菌群的檢測(cè)結(jié)果為3.623，指定值為3.732，值為0.52;值均<2，兩個(gè)樣品的結(jié)果評(píng)價(jià)為滿意。

3 結(jié)論與討論

本次大腸菌群能力驗(yàn)證結(jié)果報(bào)告與指定值相比數(shù)值偏低，分析原因可能是：①人員操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，樣品處理后應(yīng)立即進(jìn)行檢驗(yàn)，操作時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致菌體死亡，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果偏低;②操作過(guò)程中，樣品稀釋不規(guī)范或均質(zhì)時(shí)間過(guò)短會(huì)也會(huì)直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果;③樣品的存儲(chǔ)和運(yùn)輸應(yīng)該嚴(yán)格按照要求執(zhí)行，否則可能到導(dǎo)致結(jié)果出現(xiàn)偏差;④樣品冷凍后沒(méi)有放置達(dá)到室溫即開(kāi)始實(shí)驗(yàn)，溫度迅速升高導(dǎo)致菌體破裂受損，在規(guī)定的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)菌體沒(méi)有完全恢復(fù)，導(dǎo)致計(jì)數(shù)時(shí)菌數(shù)低[5];⑤VRBA作為一種選擇性培養(yǎng)基，性能決定了檢測(cè)結(jié)果質(zhì)量的高低，還應(yīng)加強(qiáng)關(guān)鍵培養(yǎng)基和試劑的性能驗(yàn)收。

為保障本次大腸菌群能力驗(yàn)證結(jié)果的準(zhǔn)確性，本實(shí)驗(yàn)室采用多個(gè)稀釋度和3M大腸菌群紙片對(duì)照等技術(shù)手段。3M大腸菌群測(cè)試片含有VRB培養(yǎng)劑(Violet Red Bile)，一種冷水可溶性的凝膠劑和四唑翁(tetrazollium)指示劑，可增強(qiáng)菌落計(jì)數(shù)效果。表面覆蓋的膠膜，可留住發(fā)酵乳糖的大腸菌群產(chǎn)生的氣體。能力驗(yàn)證結(jié)果反饋表明，3M紙片法的檢測(cè)結(jié)果更接近指定值，測(cè)試片的檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠，且其具有快速簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，可作為實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)的輔助手段和大批量食品微生物快速檢測(cè)方法。在以后的能力驗(yàn)證考核中，還可加入基質(zhì)輔助激光解吸/電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(MALEI-TOF-MS)等技術(shù)手段，對(duì)結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步確證，可以排除干擾菌，使檢驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)

[1]劉云國(guó).食品衛(wèi)生微生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)鑒定圖譜[M].北京:科學(xué)出版社,2009.

[2]許金榜.VRBA和3M PetrifilmTM快速測(cè)試片定量檢測(cè)大腸菌群的性能比較研究[J].質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督研究,2021,1(73):

17-22.

[3]中國(guó)合格評(píng)定國(guó)家認(rèn)可委員會(huì).能力驗(yàn)證規(guī)則：CNAS-RL02：2018[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2018.

[4]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 大腸菌群計(jì)數(shù):

GB 4789.3—2016[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2016.

[5]趙麗,申玉金,胡寶翠,等.多種不同方法對(duì)微生物能力驗(yàn)證樣品測(cè)試結(jié)果的比較及分析[J].食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào),2021,12(1):320-325.