超高效液相色譜一串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)食品中15種

　　

　　真菌毒素含量

　　

　　鄧新煜1，張健希'2，張京華1

　　

　?。?.遼寧省檢驗(yàn)檢測(cè)認(rèn)證中心，遼寧沈陽(yáng) 110026;2.盤錦市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，遼寧盤錦 124000）

　　

　　摘 要∶目的∶建立超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem MassSpectrometry，UPLC-MS/MS）同時(shí)測(cè)定食品中 15種真菌毒素的方法。方法∶ 樣品經(jīng) 50乙腈水溶液提取后，MycoSpinTM400凈化柱凈化，同位素內(nèi)標(biāo)稀釋后，上機(jī)測(cè)定。 結(jié)果∶ 在低、中和高水平下，這15種真菌毒素的平均回收率為68.87～109.24??精密度在1.97??12.88??15種真菌毒素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，線性系數(shù)均大于0.995，檢出限（LOD，S/N=3）和定量限（LOQ，S/N=10）分別為0.6～ 8.0 μg/kg和1.8～24.0 μg/kg。對(duì)生產(chǎn)日期為 2019—2020年的多種類糧油食品進(jìn)行15種真菌毒素的檢測(cè)工作，結(jié)果顯示黃曲霉毒素B1和玉米赤霉烯酮的陽(yáng)性檢出率最高。結(jié)論該方法靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適合于食品中多種真菌毒素的同時(shí)快速檢測(cè)。

　　

　　關(guān)鍵詞∶超高效液相色譜 - 串聯(lián)質(zhì)譜法;食品;真菌毒素

　　

　　真菌毒素是食物或飼料中生長(zhǎng)的真菌產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物， 對(duì)人類和動(dòng)物有害。早在11世紀(jì)就出現(xiàn)過(guò)真菌毒素中毒事 件，麥角菌核中的生物堿是造成中毒的主要原因，因此該病 被稱為麥角菌病。麥角急性中毒的癥狀是產(chǎn)生幻覺(jué)和肌肉痙 攣，引起四肢動(dòng)脈持續(xù)收縮和壞死。食用發(fā)霉的谷物制成的 面包會(huì)引發(fā)惡心、嘔吐等癥狀。真菌毒素具有高度污染、劇 毒、穩(wěn)定的理化性質(zhì)，在食品加工，運(yùn)輸以及儲(chǔ)存過(guò)程中已 存在很長(zhǎng)時(shí)間，很難破壞。其通過(guò)受污染的食物以及飼料直 接進(jìn)入人體以及動(dòng)物體，或通過(guò)動(dòng)物產(chǎn)品間接進(jìn)入食物鏈， 在人類以及動(dòng)物體內(nèi)長(zhǎng)期積累可導(dǎo)致神經(jīng)毒性、致畸性、致 腎毒性、致癌性、致突變性以及致細(xì)胞毒性。

　　

　　根據(jù)污染的普遍度及毒性危害嚴(yán)重性分析，黃曲霉毒素 B]、伏馬毒素B]、玉米赤霉烯酮及脫氧雪腐鐮刀菌烯醇是 真菌毒素中具有劇毒且致癌的化學(xué)物質(zhì)，也是近5年國(guó)家食 品安全監(jiān)督抽檢中重點(diǎn)監(jiān)測(cè)的檢驗(yàn)項(xiàng)目。

　　

　　傳統(tǒng)的霉菌毒素檢測(cè)方法主要有薄層色譜法(TLC)、 酶聯(lián)免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)等。這些方 法一般只能針對(duì)一種或一類結(jié)構(gòu)類似的毒素進(jìn)行快速篩選、 定性或定量檢測(cè)[11«薄層色譜法簡(jiǎn)捷、便利，但重現(xiàn)性差、 精密度低；酶聯(lián)免疫法特異性強(qiáng)、前處理簡(jiǎn)單，但假陽(yáng)性率 高，不能作為確證方法；氣質(zhì)聯(lián)用法需要衍生化前處理、操 作費(fèi)時(shí)費(fèi)力図。與其他真菌毒素檢測(cè)方法相比，液相色譜- 串聯(lián)質(zhì)譜法，集高效分離和多組分定性與定量檢測(cè)于一體， 成為近年來(lái)霉菌毒素多殘留檢測(cè)技術(shù)的主流方向。

　　

　　本研究利用Mycospin ™ 400前處理技術(shù)加上同 位素內(nèi)標(biāo)技術(shù)，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 (Ultra Performance Liquid Chromatography-tandem Mass Spectrometry, UPLC-MS/MS)同時(shí)測(cè)定花生、玉米、大豆 油等糧油食品中的15種真菌毒素的分析方法，為痕量多種 真菌毒素和代謝物的同時(shí)檢測(cè)提供了一個(gè)方便、快速、高效、 低成本、高通量、標(biāo)準(zhǔn)化的環(huán)境友好型檢測(cè)技術(shù)手段。

　　

　　1材料與方法

　　

　　1.1儀器與材料

　　

　　美國(guó)AB SCIEX 4000Q超髙效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀 (美國(guó)Agilent公司)；Milli-Q超純水儀(德國(guó)默克密理 博公司)；Picol7微量離心機(jī)(美國(guó)賽默飛世爾公司)； BP211D分析天平(德國(guó)賽多利斯公司)；MM400型混合 研磨儀(德國(guó)RETSCH GmbH)o

　　

　　甲醇、乙睛、乙酸、醋酸：色譜純，德國(guó)Merck公司； 15種真菌毒素 黃曲霉毒素Bi(AFBD、黃曲霉毒素B2(AFB2), 黃曲霉毒素G (AFGi)、黃曲霉毒素G2 (AFG2)、伏馬菌 素Bi (FBD、伏馬菌素B2 (FB2)、伏馬菌素B3 (FB3)、 嘔吐毒素(DON)、15-乙酰基嘔吐毒素(15-ACDON)、 3-乙酰基嘔吐毒素(3-ACDON)、T2毒素(T-2)、HT2毒 素(HT-2)、玉米赤霉烯酮(ZEN)、赭曲霉毒素A(OTA)、 雪腐鐮刀菌烯醇(NIV)。黃曲霉毒素混標(biāo)包含Bi、GP濃度 為2ng/mL和Bz、G2,濃度為0.5 ng/mL；伏馬毒素混標(biāo)包含 伏馬毒素Bi、伏馬毒素B2和伏馬毒素B3,濃度均為50 ng/mL； 嘔吐毒素、鐮刀菌烯酮、15-乙?；鶉I吐毒素、3-乙酰基嘔 吐毒素、T2毒素、HT2毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲霉毒素A 濃度均為10 ng/mL,以及6種同位素內(nèi)標(biāo)U-LGJ-伏馬毒 素Bi (25 ng/mL)、U-F%]-伏馬毒素B?、U-性打-伏馬 毒素 B3 濃度為 10 ng/mL、U-[13Cj5]-嘔吐毒素(25 ng/mL)、 U-[13C18]-玉米赤霉烯酮濃度為25颶/mL、U-f13^]-赭曲 霉毒素A濃度為10 jig/mL(奧地利ROMER LABS公司)； MycoSpin ™ 400多功能凈化柱(奧地利ROMER LABS公司)。 1.2實(shí)驗(yàn)方法

　　

　　1.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

　　

　　分別配制正離子標(biāo)準(zhǔn)曲線和負(fù)離子標(biāo)準(zhǔn)曲線，75pL不 同濃度混標(biāo)加上75皿同位素內(nèi)標(biāo)混標(biāo)混合后進(jìn)樣，正、負(fù) 離子濃度如表1、表2所示印。標(biāo)準(zhǔn)曲線現(xiàn)配現(xiàn)用，如未能 及時(shí)使用，在-20 °C冰箱最多保存1周。

　　

　　1.2.2樣品前處理

　　

　　稱取試樣(25±0.1) g至250mL三角瓶中，加入100 mL 50%乙臘水溶液，于搖床上(250 r/mim)振搖90 min, 過(guò)濾上清液。取10 mL濾液至試管，同時(shí)加入500 gL 乙酸渦旋振蕩，混勻后從試管中取750皿樣液加入 MycoSpin ™ 400多功能凈化柱中，蓋上蓋子渦旋振蕩 1 min,待樣液的顏色變成淺藍(lán)色，折斷MycoSpin™400多 功能凈化柱下端封口，將柱放于離心管，以10 000 r/min離 心30 s。離心后濾液存留于離心管內(nèi)，從離心管中取75 pL 樣液分別加入75 gL正離子內(nèi)標(biāo)或75 gL負(fù)離子內(nèi)標(biāo)，渦旋 振蕩20 s,上機(jī)進(jìn)樣叫

　　

　　1.2.3色譜條件

　　

　　色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18, 1.7 um, 2.1 mmx 100 mm；柱溫：40 °C；流速：0.3 mL/min；進(jìn)樣量： 5hL；流動(dòng)相A為乙臘溶液，B為0.1%甲酸水(ESI+) /0.01% 氨水溶液(ESI-),梯度洗脫條件如表3所示。

　　

　　1.2.4質(zhì)譜條件

　　

　　電噴霧離子源(Electrospray ionization, ESI):正離子、 負(fù)離子分別掃描；離子源溫度：正離子模式600 °C,負(fù)離 子模式520 °C；氣簾氣：20 psi；碰撞氣：中等；電噴霧電 壓：正離子模式：5 500 V,負(fù)離子模式：4 500 V； Gasl： 55 psi, Gas2： 50 psi；其他質(zhì)譜條件參見(jiàn)表4。

　　

　　2結(jié)果與分析

　　

　　2.1前處理方法的選擇

　　

　　本研究釆用MycoSpin ™ 400多功能凈化柱，進(jìn)一步優(yōu) 化提取時(shí)間和提取溶劑等條件。釆用MycoSpin ™ 400凈化 柱能滿足對(duì)所有真菌毒素回收率均能達(dá)到70%?130%。

　　

　　2.2流動(dòng)相的選擇

　　

　　運(yùn)用相同的洗脫程序，選擇3種不同的流動(dòng)相對(duì)15種 化合物進(jìn)行分析。結(jié)果顯示流動(dòng)相A設(shè)置：乙睛；流動(dòng)相 B設(shè)置：0.1%甲酸水(ESI+) /0.01%氨水溶液(ESI-) , 15 種真菌毒素均有較好的響應(yīng)。

　　

　　2.3質(zhì)譜條件的優(yōu)化

　　

　　本試驗(yàn)釆用對(duì)于極性特征化合物具有良好電離作用的 ESI電離源，將各真菌毒素的高濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液釆用單標(biāo)進(jìn)樣, 根據(jù)已確定的色譜條件，通過(guò)比較確定各真菌毒素的離子化 模式。在選定的離子化模式基礎(chǔ)上，不斷調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓、 錐孔電壓、源溫度、脫溶劑氣溫度、脫溶劑氣流量、錐孔氣 流量等質(zhì)譜參數(shù)來(lái)進(jìn)一步提高各母離子的信號(hào)水平[4]»在確 定各化合物母離子后，通過(guò)掃描方式獲得2個(gè)以上的子離子, 在豐度由大到小且避免產(chǎn)生相互干擾的原則下，每種真菌毒 素化合物最終確定了 2個(gè)監(jiān)測(cè)離子對(duì)。通過(guò)15種真菌毒素 的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(Multitude Reaction Mode, MRM)色譜圖，質(zhì) 譜條件可以保證質(zhì)譜峰的良好峰型和豐度。

　　

　　2.4方法學(xué)考察

　　

　　2.4.1線性關(guān)系、檢出限以及定量限

　　

　　配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，將15種真菌毒素混標(biāo)和正負(fù)離子內(nèi)標(biāo) 混合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)表5。由表5可知，15種真菌 毒素在各自的線性范圍內(nèi)均可得到良好的線性關(guān)系，相關(guān)系 數(shù)（產(chǎn)）均能達(dá)到0.995以上。真菌毒素的檢出限用3倍信噪 比來(lái)確定，而定量限則用10倍信噪比來(lái)確定，其中，信噪 比為S比N的比值。

　　

　　2.4.2回收率和精密度

　　

　　選擇花生、玉米、小米、慧米和花生油等不同基質(zhì)的樣 品，檢査15種真菌毒素在低、中和高濃度下的回收率。結(jié) 果見(jiàn)表6。在低、中和高水平下，這15種真菌毒素的平均 回收率為68.87%?109.24%,精密度在1.97%?12.88%。 2.5食品檢測(cè)中的應(yīng)用

　　

　　通過(guò)文獻(xiàn)搜索和過(guò)去3年來(lái)自國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局公示 的不合格樣品信息，選定生產(chǎn)日期為2019—2020年，標(biāo)識(shí)生 產(chǎn)者地址為廣西、上海、浙江、江蘇、遼寧和四川等地的150 批次食品樣品，地區(qū)類型包括城市、農(nóng)村地區(qū)、風(fēng)景名勝旅游 區(qū)和校園周邊。釆樣環(huán)節(jié)包括常規(guī)釆樣、農(nóng)產(chǎn)品釆樣和網(wǎng)絡(luò)釆 樣。抽樣地點(diǎn)包括農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)、雜貨店、超級(jí)市場(chǎng)和網(wǎng)絡(luò)購(gòu)物。 樣品種廂花生、球、慧米、小米、花生油、大豆油、甜面 醬、番茄醬、芝麻醬、醬油。釆用建立的UPLC-MS/MS的方 法對(duì)150份上述類別中的10種食品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果見(jiàn)表7。

　　

　　由表7可知，花生油中黃曲霉毒素B］陽(yáng)性檢出率最高， 高達(dá)32.00%,慧米的玉米赤霉烯酮陽(yáng)性檢出率較高，高達(dá) 31.81%,而玉米的玉米赤霉烯酮陽(yáng)性率也達(dá)到15.00%,這 可能是由于鐮刀菌屬的菌株易在惹米和玉米作物中生長(zhǎng)繁 殖，且常存在多種毒素同時(shí)并存的情況，比如部分花生樣品 中同時(shí)含有黃曲霉毒素B］和伏馬毒素B］,部分花生油同時(shí) 檢出黃曲霉毒素B］和黃曲霉毒素B2.

　　

　　3結(jié)語(yǔ)

　　

　　本研究基于MycoSpin ™ 400前處理技術(shù)以及同位素內(nèi)標(biāo)稀 釋技術(shù)，結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)，建立了一種糧 油食品中15種真菌毒素的檢測(cè) g 1次預(yù)處理以及1次進(jìn)樣 即可同時(shí)檢測(cè)食物中多種真菌毒素。同時(shí)，運(yùn)用定性以及定量 離子進(jìn)行蛔 捷、頗、低赫、高性能、高標(biāo)準(zhǔn)、

　　

　　環(huán)保、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確可靠，可同時(shí)檢測(cè)痕量不同的真菌 毒素和代謝產(chǎn)物，適用于食品中多種真菌毒素的同時(shí)檢測(cè)。

　　

　　參考文獻(xiàn)

　　

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