PCR 檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
PCR 檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
洪 亮
?。ㄉ虾5轮Z產(chǎn)品檢測有限公司,上海 200436)
作者簡介:洪亮(1990—),男,江蘇靖江人,本科,助理工程師。研究方向:食品安全。
摘 要:PCR作為分子生物學的基礎(chǔ)技術(shù),已經(jīng)在環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等眾多領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。目前,多項食品安全國家標準中在生物鑒定環(huán)節(jié)也已引入PCR檢測方法。中華人民,共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準、中華人民,共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準等多項標準引用該方法。本文就傳統(tǒng)微生物檢測方法存在的問題引出對各項 PCR 檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行列舉分析,提出各檢測方面的實際用途以及優(yōu)缺點,以期為未來的 PCR 檢測技術(shù)發(fā)展提供方向。
關(guān)鍵詞∶聚合酶鏈式反應(yīng);食品;檢測
1傳統(tǒng)微生物檢測方法存在的問題
每年夏季都是食源性疾病高發(fā)期,金黃色葡萄球菌、志 賀氏菌、大腸埃希氏菌和副溶血性弧菌等都是食品中較為常 見的致病菌,易引發(fā)人畜疾病,應(yīng)進行嚴格質(zhì)檢,確保食 品安全。目前,食品微生物檢測的國家通用標準主要為GB 4789系列,共計40多個標準方法,大部分標準方法都是釆 用培養(yǎng)法進行檢測分析。少數(shù)標準方法,例如GB 4789.6中 致瀉大腸埃希氏菌檢驗、GB 4789.42中諾如病毒檢驗等釆 用了聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法。傳統(tǒng)檢測方法(培養(yǎng)法)的一般 流程為樣品稱量、增菌(預培養(yǎng))、分離純化、生理生化鑒定、 菌株血清分型等,菌落形態(tài)觀察、菌株生化鑒定及血清學分 型等冗繁的操作歷時較長,對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件要求也較嚴 苛,易導致漏檢,且無法滿足部分廠商要求的快速檢測周期, 不利于及時發(fā)現(xiàn)問題、解決問題。此外,部分檢測用試劑毒 性較大,對檢測人員身體健康也容易造成威脅。同時,對于 新冠病毒等不便于培養(yǎng)的微生物來說,傳統(tǒng)的檢測方法也無 從解決檢測需求。
近年來,隨著分子生物學檢測技術(shù)的快速發(fā)展,微生物 檢測的方法也日趨多元化、現(xiàn)代化。流式細胞儀、PCR儀 (Real-time PCR, RT-PCR等)、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層 析測定等多種較新的檢測方法或儀器的加入叫也使得食品 微生物檢測的靈敏度、特異性和檢測速度得到了極大的提升, 這些更為快捷、準確的檢測技術(shù)也更能適應(yīng)人們對食品產(chǎn)品 質(zhì)量的要求。
2 PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀
PCR又稱聚合酶鏈式反應(yīng),是通過儀器和試劑在體外模 擬天然DNA復制的過程,可在較短時間內(nèi)獲得大量目的基 因片段,再通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光檢測技術(shù)等對目的片 段進行分析確認,最終可實現(xiàn)對食源性微生物進行準確的定 性分析。目前PCR作為分子生物學基礎(chǔ)技術(shù),目前已經(jīng)在 環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等多領(lǐng)域得到了較為廣泛的 應(yīng)用四,特別是新冠疫情爆發(fā)之后,基于PCR技術(shù)的分子 生物學檢測技術(shù)得到了更為廣泛的應(yīng)用,尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域 及鮮活農(nóng)產(chǎn)品及食品領(lǐng)域的應(yīng)用較之前更為頻繁。
PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用與其在其他 領(lǐng)域的應(yīng)用類似,需要特異性的引物與靶序列進行結(jié)合引 導反應(yīng)的開始,整個反應(yīng)包括DNA模板的變性解鏈、復性 (或稱退火)模板與引物結(jié)合、子鏈延伸等過程的不斷循環(huán), 實現(xiàn)DNA的指數(shù)級增長,最終在短時間內(nèi)獲得更多的目的 DNA片段,用于后續(xù)的凝膠電泳和基因測序等分析,以確 定擴增DNA的具體序列信息。PCR檢測技術(shù)非常適用于對 生長條件要求特殊,不容易實現(xiàn)常規(guī)增菌培養(yǎng)的微生物的檢 測、鑒定和分型。較常釆用的有常規(guī)PCR技術(shù)、實時熒光 定量PCR技術(shù)、RT-PCR檢測技術(shù)以及基于PCR的基因芯 片檢測技術(shù)等4種團。
目前在食品領(lǐng)域這4種檢測技術(shù)不僅可用于微生物檢 測,還能應(yīng)用在疫病檢測、食品種質(zhì)資源鑒定、食物中轉(zhuǎn)基 因成分檢測、食物中過敏源成分檢測、藥食同源樣品基源鑒 定和產(chǎn)品真?zhèn)舞b別等方面。
2.1常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用一般用于同 時檢測多種食源性微生物以及對分離純化后的微生物進行 菌種鑒定等領(lǐng)域。前者主要通過在反應(yīng)體系中同時加入多種 致病微生物的特異性引物以實現(xiàn)多個目的基因片段同時擴 增,共同分析,縮短檢測周期、縮減檢測費用的目標。后者 主要用于提高傳統(tǒng)檢測方法的準確率,防止漏檢、錯檢,也 適用于對未知菌株進行鑒定分型,為食品生產(chǎn)實踐過程中準 確分析污染源和制定針對性的除菌措施提供指導方向[4]o但 是常規(guī)PCR技術(shù)雖然造價較便宜,應(yīng)用最為廣泛,但是也 只能單純的用作基因擴增,后續(xù)的基因分析還需要借助電泳 技術(shù)、熒光檢測技術(shù)或測序技術(shù)才能達到最終的檢測目標。 而且在后續(xù)染色環(huán)節(jié)還會用到漠化乙錠,易對檢測人員的身 體健康造成威脅。
2.2實時熒光定量PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
實時熒光定量PCR技術(shù),是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上,在 反應(yīng)體系中加入熒光信號再利用儀器對信號進行監(jiān)測,從而實現(xiàn)對起始模板進行定量和定性分析的方法。利用該技術(shù)對 食品微生物進行分析,可以避免在檢測過程中的交叉污染, 也省去了后續(xù)漠化乙錠等有毒物質(zhì)染色及紫外熒光檢測等 步驟,自動化程度更高,特異性更強。當前,食品中多種致 病菌檢測以及霉菌、酵母、乳酸菌等定性及定量檢測都可釆 用該方法叫 雖然設(shè)備成本相對較高,但是節(jié)省人力,且更 為精準,目前應(yīng)用較為廣泛'物。
2.3基于PCR的基因芯片檢測技術(shù)
基因芯片是目前較先進的一種高通量核酸分子雜交技 術(shù),它通過原位合成或顯微打印技術(shù)將核酸分子探針按照擬 定的順序固定到固相介質(zhì)芯片的表面,在將樣品的核酸分子 提取經(jīng)PCR擴增后與該具有高密度的寡核昔酸陣列的芯片 上的探針進行雜交,最后再借助熒光掃描等技術(shù)對雜交信號 進行檢測,以確定樣品中特定微生物的存在情況回。
大部分食品營養(yǎng)較為豐富,同時具備碳源、氮源、生長 因子等微生物生長需要的成分,適合多種微生物的生長繁 殖,因此很多食品樣品中微生物的種類較為繁雜、品種分布 隨機性強,而傳統(tǒng)的增菌、培養(yǎng)、純化鑒定等方法可能會導 致部分低豐度以及不容易培養(yǎng)的微生物漏檢,常規(guī)PCR多 限于檢測幾種微生物的基因,無法全面分析食品受污染的具 體狀況,對于生產(chǎn)者改良工藝提升產(chǎn)品質(zhì)量指導意義不強。 而基因芯片具備的高通量、高度自動化等優(yōu)點,可以為食品 微生物種類研究、致病菌毒力研究、藥敏基因檢測等提供有 力的數(shù)據(jù)支持頃山。此方法準確度高、可操作性強,但是 成本相對較高,目前在食品微生物檢測中應(yīng)用尚不廣泛回。 但是隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和完善,基因芯片的制 作成本日益下降,相信在不久的將來,應(yīng)該也會得到大范圍 的應(yīng)用。
2.4 RT-PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用
RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR,是通過將RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,再通過常規(guī)的聚合酶鏈式擴增反應(yīng)(PCR)實現(xiàn)在體 外快速擴增cDNA的過程。該技術(shù)多用于檢測食品中RNA 病毒污染,例如新冠病毒等檢測。疫情期間,三文魚、櫻桃 等檢測出新冠病毒,多釆用該法進行。但是該法使用范圍較 窄,一般僅用于以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒的檢測中,其他 微生物檢測不適用于該法。
3結(jié)語
由微生物(致病細菌、生物毒素、病毒等)造成的食源性 危害嚴重時可危及生命,檢測技術(shù)的進步使得人們能夠及時 發(fā)現(xiàn),預防其對人類健康造成嚴重危害。目前基于PCR技 術(shù)的食品微生物檢測應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛,商業(yè)化程度較高, 它一方面可以用于檢測食品中的致病菌存在情況,從而有效 防止食源性風險發(fā)生,另一方面也可以對食品中的菌相進行 分析,對于食品發(fā)酵和食品工藝改進等方面也有重大意義■ 此外,在水生動物疫病檢測、畜禽疫病檢測、農(nóng)作物種質(zhì)資 源鑒定、食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測、食品中過敏源檢測、物種 鑒定、中藥材及食品真?zhèn)舞b別等方面,PCR作為基礎(chǔ)技術(shù) 也被廣泛應(yīng)用??傊瑹o論是植物源食品還是動物源食品, 只要是涉及基因檢測,就一定會使用到PCR技術(shù),PCR已 經(jīng)成為檢測技術(shù)中最為常見的基礎(chǔ)技術(shù)手段皿。
目前,雖然PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛,但是基于PCR的食品 微生物檢測技術(shù)對于復雜樣品仍然存在背景干擾和假陽性 等諸多問題,為了更好地防范由有害微生物污染帶來的食品 安全風險,進一步探索針對不同樣品合適的PCR反應(yīng)體系 和反應(yīng)條件,摸索開發(fā)出更靈敏、快捷、準確、通用的檢測 技術(shù)條件也迫在眉睫。此外,圍繞PCR進行的很多化學試 劑、酶、儀器等成本相對還是較高,隨著分子生物學技術(shù)的 發(fā)展和機械工業(yè)不斷發(fā)展,試劑耗材儀器成本的降低,相信 PCR技術(shù)的使用前景將更為廣闊。
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