PCR 檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

　　

　　洪 亮

　　

　?。ㄉ虾５轮Z產(chǎn)品檢測有限公司，上海 200436）

　　

　　作者簡介：洪亮（1990—）,男，江蘇靖江人，本科，助理工程師。研究方向：食品安全。

　　

　　摘 要:PCR作為分子生物學的基礎(chǔ)技術(shù)，已經(jīng)在環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等眾多領(lǐng)域得到了較為廣泛的應(yīng)用。目前，多項食品安全國家標準中在生物鑒定環(huán)節(jié)也已引入PCR檢測方法。中華人民，共和國出入境檢驗檢疫行業(yè)標準、中華人民，共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標準等多項標準引用該方法。本文就傳統(tǒng)微生物檢測方法存在的問題引出對各項 PCR 檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀進行列舉分析，提出各檢測方面的實際用途以及優(yōu)缺點，以期為未來的 PCR 檢測技術(shù)發(fā)展提供方向。

　　

　　關(guān)鍵詞∶聚合酶鏈式反應(yīng);食品;檢測

　　

　　1傳統(tǒng)微生物檢測方法存在的問題

　　

　　每年夏季都是食源性疾病高發(fā)期，金黃色葡萄球菌、志 賀氏菌、大腸埃希氏菌和副溶血性弧菌等都是食品中較為常 見的致病菌，易引發(fā)人畜疾病，應(yīng)進行嚴格質(zhì)檢，確保食 品安全。目前，食品微生物檢測的國家通用標準主要為GB 4789系列，共計40多個標準方法，大部分標準方法都是釆 用培養(yǎng)法進行檢測分析。少數(shù)標準方法，例如GB 4789.6中 致瀉大腸埃希氏菌檢驗、GB 4789.42中諾如病毒檢驗等釆 用了聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法。傳統(tǒng)檢測方法（培養(yǎng)法）的一般 流程為樣品稱量、增菌（預培養(yǎng)）、分離純化、生理生化鑒定、 菌株血清分型等，菌落形態(tài)觀察、菌株生化鑒定及血清學分 型等冗繁的操作歷時較長，對培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件要求也較嚴 苛，易導致漏檢，且無法滿足部分廠商要求的快速檢測周期, 不利于及時發(fā)現(xiàn)問題、解決問題。此外，部分檢測用試劑毒 性較大，對檢測人員身體健康也容易造成威脅。同時，對于 新冠病毒等不便于培養(yǎng)的微生物來說，傳統(tǒng)的檢測方法也無 從解決檢測需求。

　　

　　近年來，隨著分子生物學檢測技術(shù)的快速發(fā)展，微生物 檢測的方法也日趨多元化、現(xiàn)代化。流式細胞儀、PCR儀 （Real-time PCR, RT-PCR等）、酶聯(lián)免疫吸附法和免疫層 析測定等多種較新的檢測方法或儀器的加入叫也使得食品 微生物檢測的靈敏度、特異性和檢測速度得到了極大的提升, 這些更為快捷、準確的檢測技術(shù)也更能適應(yīng)人們對食品產(chǎn)品 質(zhì)量的要求。

　　

　　2 PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用現(xiàn)狀

　　

　　PCR又稱聚合酶鏈式反應(yīng)，是通過儀器和試劑在體外模 擬天然DNA復制的過程，可在較短時間內(nèi)獲得大量目的基 因片段，再通過瓊脂糖凝膠電泳和熒光檢測技術(shù)等對目的片 段進行分析確認，最終可實現(xiàn)對食源性微生物進行準確的定 性分析。目前PCR作為分子生物學基礎(chǔ)技術(shù)，目前已經(jīng)在 環(huán)境工程、食品工程、醫(yī)藥行業(yè)等多領(lǐng)域得到了較為廣泛的 應(yīng)用四，特別是新冠疫情爆發(fā)之后，基于PCR技術(shù)的分子 生物學檢測技術(shù)得到了更為廣泛的應(yīng)用，尤其是在醫(yī)藥領(lǐng)域 及鮮活農(nóng)產(chǎn)品及食品領(lǐng)域的應(yīng)用較之前更為頻繁。

　　

　　PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用與其在其他 領(lǐng)域的應(yīng)用類似，需要特異性的引物與靶序列進行結(jié)合引 導反應(yīng)的開始，整個反應(yīng)包括DNA模板的變性解鏈、復性 （或稱退火）模板與引物結(jié)合、子鏈延伸等過程的不斷循環(huán)， 實現(xiàn)DNA的指數(shù)級增長，最終在短時間內(nèi)獲得更多的目的 DNA片段，用于后續(xù)的凝膠電泳和基因測序等分析，以確 定擴增DNA的具體序列信息。PCR檢測技術(shù)非常適用于對 生長條件要求特殊，不容易實現(xiàn)常規(guī)增菌培養(yǎng)的微生物的檢 測、鑒定和分型。較常釆用的有常規(guī)PCR技術(shù)、實時熒光 定量PCR技術(shù)、RT-PCR檢測技術(shù)以及基于PCR的基因芯 片檢測技術(shù)等4種團。

　　

　　目前在食品領(lǐng)域這4種檢測技術(shù)不僅可用于微生物檢 測，還能應(yīng)用在疫病檢測、食品種質(zhì)資源鑒定、食物中轉(zhuǎn)基 因成分檢測、食物中過敏源成分檢測、藥食同源樣品基源鑒 定和產(chǎn)品真?zhèn)舞b別等方面。

　　

　　2.1常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

　　

　　常規(guī)PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用一般用于同 時檢測多種食源性微生物以及對分離純化后的微生物進行 菌種鑒定等領(lǐng)域。前者主要通過在反應(yīng)體系中同時加入多種 致病微生物的特異性引物以實現(xiàn)多個目的基因片段同時擴 增，共同分析，縮短檢測周期、縮減檢測費用的目標。后者 主要用于提高傳統(tǒng)檢測方法的準確率，防止漏檢、錯檢，也 適用于對未知菌株進行鑒定分型，為食品生產(chǎn)實踐過程中準 確分析污染源和制定針對性的除菌措施提供指導方向[4]o但 是常規(guī)PCR技術(shù)雖然造價較便宜，應(yīng)用最為廣泛，但是也 只能單純的用作基因擴增，后續(xù)的基因分析還需要借助電泳 技術(shù)、熒光檢測技術(shù)或測序技術(shù)才能達到最終的檢測目標。 而且在后續(xù)染色環(huán)節(jié)還會用到漠化乙錠，易對檢測人員的身 體健康造成威脅。

　　

　　2.2實時熒光定量PCR技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

　　

　　實時熒光定量PCR技術(shù)，是在常規(guī)PCR的基礎(chǔ)上，在 反應(yīng)體系中加入熒光信號再利用儀器對信號進行監(jiān)測，從而實現(xiàn)對起始模板進行定量和定性分析的方法。利用該技術(shù)對 食品微生物進行分析，可以避免在檢測過程中的交叉污染， 也省去了后續(xù)漠化乙錠等有毒物質(zhì)染色及紫外熒光檢測等 步驟，自動化程度更高，特異性更強。當前，食品中多種致 病菌檢測以及霉菌、酵母、乳酸菌等定性及定量檢測都可釆 用該方法叫 雖然設(shè)備成本相對較高，但是節(jié)省人力，且更 為精準，目前應(yīng)用較為廣泛'物。

　　

　　2.3基于PCR的基因芯片檢測技術(shù)

　　

　　基因芯片是目前較先進的一種高通量核酸分子雜交技 術(shù)，它通過原位合成或顯微打印技術(shù)將核酸分子探針按照擬 定的順序固定到固相介質(zhì)芯片的表面，在將樣品的核酸分子 提取經(jīng)PCR擴增后與該具有高密度的寡核昔酸陣列的芯片 上的探針進行雜交，最后再借助熒光掃描等技術(shù)對雜交信號 進行檢測，以確定樣品中特定微生物的存在情況回。

　　

　　大部分食品營養(yǎng)較為豐富，同時具備碳源、氮源、生長 因子等微生物生長需要的成分，適合多種微生物的生長繁 殖，因此很多食品樣品中微生物的種類較為繁雜、品種分布 隨機性強，而傳統(tǒng)的增菌、培養(yǎng)、純化鑒定等方法可能會導 致部分低豐度以及不容易培養(yǎng)的微生物漏檢，常規(guī)PCR多 限于檢測幾種微生物的基因，無法全面分析食品受污染的具 體狀況，對于生產(chǎn)者改良工藝提升產(chǎn)品質(zhì)量指導意義不強。 而基因芯片具備的高通量、高度自動化等優(yōu)點，可以為食品 微生物種類研究、致病菌毒力研究、藥敏基因檢測等提供有 力的數(shù)據(jù)支持頃山。此方法準確度高、可操作性強，但是 成本相對較高，目前在食品微生物檢測中應(yīng)用尚不廣泛回。 但是隨著分子生物學技術(shù)的不斷發(fā)展和完善，基因芯片的制 作成本日益下降，相信在不久的將來，應(yīng)該也會得到大范圍 的應(yīng)用。

　　

　　2.4 RT-PCR檢測技術(shù)在食品微生物檢測中的應(yīng)用

　　

　　RT-PCR即逆轉(zhuǎn)錄PCR,是通過將RNA逆轉(zhuǎn)錄為 cDNA,再通過常規(guī)的聚合酶鏈式擴增反應(yīng)(PCR)實現(xiàn)在體 外快速擴增cDNA的過程。該技術(shù)多用于檢測食品中RNA 病毒污染，例如新冠病毒等檢測。疫情期間，三文魚、櫻桃 等檢測出新冠病毒，多釆用該法進行。但是該法使用范圍較 窄，一般僅用于以RNA為遺傳物質(zhì)的病毒的檢測中，其他 微生物檢測不適用于該法。

　　

　　3結(jié)語

　　

　　由微生物(致病細菌、生物毒素、病毒等)造成的食源性 危害嚴重時可危及生命，檢測技術(shù)的進步使得人們能夠及時 發(fā)現(xiàn)，預防其對人類健康造成嚴重危害。目前基于PCR技 術(shù)的食品微生物檢測應(yīng)用已經(jīng)非常廣泛，商業(yè)化程度較高， 它一方面可以用于檢測食品中的致病菌存在情況，從而有效 防止食源性風險發(fā)生，另一方面也可以對食品中的菌相進行 分析，對于食品發(fā)酵和食品工藝改進等方面也有重大意義■ 此外，在水生動物疫病檢測、畜禽疫病檢測、農(nóng)作物種質(zhì)資 源鑒定、食品中轉(zhuǎn)基因成分檢測、食品中過敏源檢測、物種 鑒定、中藥材及食品真?zhèn)舞b別等方面，PCR作為基礎(chǔ)技術(shù) 也被廣泛應(yīng)用?？傊瑹o論是植物源食品還是動物源食品， 只要是涉及基因檢測，就一定會使用到PCR技術(shù)，PCR已 經(jīng)成為檢測技術(shù)中最為常見的基礎(chǔ)技術(shù)手段皿。

　　

　　目前，雖然PCR技術(shù)應(yīng)用廣泛，但是基于PCR的食品 微生物檢測技術(shù)對于復雜樣品仍然存在背景干擾和假陽性 等諸多問題，為了更好地防范由有害微生物污染帶來的食品 安全風險，進一步探索針對不同樣品合適的PCR反應(yīng)體系 和反應(yīng)條件，摸索開發(fā)出更靈敏、快捷、準確、通用的檢測 技術(shù)條件也迫在眉睫。此外，圍繞PCR進行的很多化學試 劑、酶、儀器等成本相對還是較高，隨著分子生物學技術(shù)的 發(fā)展和機械工業(yè)不斷發(fā)展，試劑耗材儀器成本的降低，相信 PCR技術(shù)的使用前景將更為廣闊。

　　

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