飼料中β-受體激動劑檢測方法前

　　

　　處理方式改進研究

　　

　　王 楠，安晨亮，安陽麗，常瑞雪*

　　

　　（河北玖辛檢測技術(shù)服務(wù)有限公司，河北保定07100）

　　

　　作者簡介∶王楠（1987—），女，河北保定人，碩士，工程師。研究方向∶食品質(zhì)量與安全。

　　

　　通信作者∶常瑞雪（1981—），女，河北保定人，碩士，工程師。研究方向∶化學分析檢測。E-mail∶23354986（@qg.com。

　　

　　摘 要∶現(xiàn)行農(nóng)業(yè)部1063號公告-6—2008，農(nóng)業(yè)部1629號公告-1-2011，NY/T 3145—2017等檢測標準都是使用外標法對飼料中的 β-受體激動劑進行檢測，而外標法在檢測飼料中 β-受體激動劑時所測數(shù)值有一定的誤差。基于此，課題組應(yīng)用內(nèi)標法對 β-受體激動劑進行測試。 內(nèi)標法的優(yōu)點是結(jié)果更準確，可以消除操作條件等變化引起的誤差。對飼料中的 β-受體激動劑提取液進行優(yōu)化，克服了原提取液中鹽酸易揮發(fā)且腐蝕性強的缺點。

　　

　　關(guān)鍵詞∶飼料;β-受體激動劑;液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法;內(nèi)標法;提取液優(yōu)化

　　

　　近年來，隨著生活水平的提高，我國居民的飲食習慣轉(zhuǎn) 向追求飲食的健康均衡，因此脂肪含量較低的瘦肉獲得更多 青睞。但是國內(nèi)外頻發(fā)的食品污染和中毒事件，使食品安全 問題成為消費者、政府等關(guān)注的焦點問題。其中片受體激 動劑的殘留一直是肉制品安全的難題，它不僅影響我國的畜 牧產(chǎn)品的出口貿(mào)易，還威脅著消費者的健康，因此該類藥物 逐漸被禁止用于畜禽生產(chǎn)[1]=

　　

　　片受體激動劑閔是腎上腺素類"激動劑"興奮劑等 一類藥物的統(tǒng)稱，當以超過治療劑量5-10倍的用量用于家 畜飼養(yǎng)時，會干擾胰島素的釋放，加快體內(nèi)糖原和脂肪的 分解叫從而能顯著提高胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉(zhuǎn) 化率，帶來更多經(jīng)濟價值。但它對人體有很危險的副作用， 對于患有高血壓、心臟病、甲亢和前列腺肥大等疾病的人影 響和危害更大，嚴重者可危及生命四。中國農(nóng)業(yè)部1997年 發(fā)文禁止瘦肉精在飼料和畜牧生產(chǎn)中使用，2001年12月27 日、2002年2月9日、4月9日，農(nóng)業(yè)部分別下發(fā)文件禁止 使用阡受體激動劑類藥物作為飼料添加劑。盡管國家針對 瘦肉精問題明令禁止，但是在利益的驅(qū)動下，片受體激動 劑仍被大量非法用于畜牧生產(chǎn)閔，動物性食品中因而出現(xiàn)了 不同程度的藥物殘留。阡受體激動劑殘留問題導(dǎo)致了許多 食物中毒事件，所以需要從源頭抓起，做好飼料中"瘦肉精” （片受體激動劑）的檢測，杜絕瘦肉精在養(yǎng)殖過程中的使用， 從根本上杜絕該類添加劑的有害殘留。

　　

　　P-受體激動劑在食品中殘留會對人體產(chǎn)生危害，對其準確、 快速地檢測非常重要，從國家到地方aw都非常重視?，F(xiàn)行農(nóng) 業(yè)部1063號公告-6—2008、農(nóng)業(yè)部1629號公告T—2011、 NY/T3145—2017等檢測標準都是使用外標法對飼料中的片受 體激動劑進行檢測，由于在飼料中提取P■受體激動劑存在一 定的缺陷，所以外標法所測數(shù)值有一定的誤差。針對這個問題 本課題組應(yīng)用內(nèi)標法對P-受體激動劑進行測試，內(nèi)標法的優(yōu) 點是結(jié)果更準確，可以消除操作條件等變化引起的誤差。

　　

　　1材料與方法

　　

　　1.1材料與試劑

　　

　　甲醇、甲酸均為色譜純；濃鹽酸、磷酸、醋酸、三氟乙 酸、氨水和醋酸鉛均為分析純；MCX混合型陽離子交換柱 （60 mg/3 mL）；標準物質(zhì)沙丁胺醇，購自中國食品藥品檢 定研究院；萊克多巴胺、、鹽酸克倫特羅、同位素內(nèi)標物萊 克多巴胺-D9和沙丁胺醇-D3,均購自北京壇墨質(zhì)檢科技 有限公司，純度均N98%；實驗用水由純水儀制備，德國 賽多利斯Sartorius公司。

　　

　　1.2儀器與設(shè)備

　　

　　液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀由1100液相色譜儀（安捷倫科 技有限公司）API 4000三重四級桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB SCIEX公司）組成，其他儀器設(shè)備包括TD10002C電子天平、 RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器,QL-901旋渦混合器、水浴恒溫振蕩器、 超低溫離心機、CM-12氮吹儀和SPE-24固相萃取裝置。

　　

　　1.3標準溶液配制

　　

　　1.3.1外標法標準溶液的配制

　　

　　標準物質(zhì)選取了萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇，用 甲醇配制成1 Hg-mL'1的混標儲備液，避光冷藏保存。

　　

　　1.3.2內(nèi)標法標準溶液的配制

　　

　　內(nèi)標物選取了萊克多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3,用甲醇 配制成100 ng/mL的混標儲備液，避光冷藏保存。

　　

　　1.4方法

　　

　　1.4.1提取液

　　

　　配制了 4種不同提取液，分別為鹽酸-甲醇提取液、磷 酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提 取液，分別取0.1mol/L鹽酸、磷酸、醋酸和三氟乙酸溶液 80 mL,再分別加入甲醇20 mL混勻。

　　

　　1.4.2提取方法

　　

　　分別稱取2 g左右粉碎過篩好的飼料樣品，于50 mL離 心管中，準確加入19 mL提取液和1 mL飽和醋酸鉛溶液，渦旋混合30 s,超聲提取10 min,再渦旋混合30 s,超聲提 取10 min,然后于8 000 r/min離心10 min,取上清液備用。

　　

　　1.4.3凈化

　　

　　先將MCX固相萃取小柱，依次用3 mL甲醇、3 mL 水活化，取上清液5 mL過柱，用2 mL水和2 mL甲醇依次淋洗，空氣抽干2 min,用5%氨水甲醇溶液5 mL洗脫,收集洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(40?！吨粮?用1.0 mL 0.2%甲酸水溶液溶解，過0.22卩m有機濾膜后， 待上機測定。

　　

　　1.4.4色譜條件

　　

　　色譜柱：C18柱, 150 mmx2.1 mm,粒度 3.5 pm(2020-

　　

　　SPZ-07-01),柱溫40 °C,進樣體積：5pL,流動相A：甲醇，

　　

　　流動相B： 0.2%甲酸水溶液，流速：0.3mL/min,梯度洗脫程序見表1。

　　
　　1.4.5質(zhì)譜條件

　　

　　掃描方式：正離子掃描；監(jiān)測方式: MRM多反應(yīng)監(jiān)測，

　　

　　MRM參數(shù)見表2； 噴霧電壓：5 500V； 氣體溫度：550 °C o

　　2結(jié)果與分析

　　

　　2.1內(nèi)外標法的優(yōu)化

　　

　　稱取2g左右空白飼料樣品，分為兩組，一組加入 lOgg/kg萊克多巴胺、克倫特羅、沙丁胺醇的標準物質(zhì)混合 液，另一組加入等量標準物質(zhì)混合液后，再加入等量的萊克 多巴胺-D9、沙丁胺醇-D3混標儲備液。加標后釆用鹽酸- 甲醇提取液的方式進行前處理，設(shè)置空白對照，測定3種 阡受體激動劑的回收率和精密度。從表3中可以看出，外 標法測定的回收率為77.0%、77.2%、77.5%,內(nèi)標法測定的 回收率為102.5%、103.2%、100.2%=結(jié)果表明，內(nèi)標法的 回收率較外標法有顯著提高，精密度良好，檢測結(jié)果更接近 于真值。

　　

　　2.2提取方法的優(yōu)化

　　

　　稱取2 g左右空白飼料樣品分為4組，均加入等量內(nèi)標 混標儲備液和10 ng/kg外標混標儲備液，即釆用內(nèi)標法， 加標后分別加入4種不同的提取液，即鹽酸-甲醇提取液、 磷酸-甲醇提取液、醋酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇 提取液，按照上述的前處理方式進行處理，同時設(shè)置空白 對照，測定4種不同提取液處理后的片受體激動劑的回收 率和精密度。從表4中可以看出，鹽酸-甲醇提取液處理 后的回收率為99.5%、99.4%、98.1%,磷酸-甲醇提取液回 收率為82.8%、82.8%、96.2%,醋酸-甲醇提取液回收率 為90.5%、87.0%、98.5%,三氟乙酸-甲醇提取液回收率 為82.9%、81.0%、94.8%。濃鹽酸-甲醇提取液的回收率最 好，但濃鹽酸易揮發(fā)，且腐蝕性強；醋酸-甲醇提取液的回 收率稍遜于鹽酸-甲醇提取液，但相對揮發(fā)性小，沒有腐蝕 性，較安全；磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的 回收率相對較低，因此最終選擇醋酸-甲醇作為提取飼料中 P-受體激動劑的提取液。

　　

　　3結(jié)論

　　

　　實驗結(jié)果表明，內(nèi)標法的回收率較外標法有顯著提高， 精密度良好，檢測結(jié)果更接近于真值。設(shè)計不同的提取液對 飼料中的片受體激動劑進行提取，結(jié)果表明，濃鹽酸-甲 醇提取液的回收率最好，但濃鹽酸易揮發(fā)，且腐蝕性強；醋 酸-甲醇提取液的回收率稍遜于鹽酸-甲醇提取液，但相對 揮發(fā)性小，沒有腐蝕性，較安全；磷酸-甲醇提取液和三氟乙酸-甲醇提取液的回收率相對較低，最終選擇醋酸-甲醇 作為提取飼料中P-受體激動劑的提取液。雖然我國在食品 安全領(lǐng)域逐漸加大了監(jiān)管力度，并建立了數(shù)量眾多的各級食 品檢測中心，但阡受體激動劑作為廉價的促進動物生長劑 仍有不法分子會使用，所以有必要繼續(xù)開發(fā)靈敏度高、檢測 速度快、準確度高的檢測方法。

　　

　　參考文獻

　　

　　[1]SHAO B,JIA X EZHANG J,et aLMulti-residual analysis of 16 p-agonists in pig liver; kidney and muscle by ultra performance liquid chromatography tandem mass spectrometry [J] .Food Chemistry 2009,114(3):1115-1121.

　　

　　[2]LIU R,LIU L Q,SONG S S,et al.Development of an immunochromatographic strip for the rapid detection of 10 P-agonists based on an ultrasensitive monoclonal antibody [J] .Food and A gricultural Immunology,2017,28(4):1-14.

　　

　　[3]王培龍受體激動劑及其檢測技術(shù)研究[J],農(nóng)產(chǎn)品質(zhì) 量與安全,2014(1)： 44-52.

　　

　　[4]劉敏，劉戎，王立琦，等,豬肝中P-受體激動劑多殘留 的樣品前處理方法比較及同時檢測[J].分析測試學報2012, 31(3)： 290-295.

　　

　　[5]顧亮，丁磊.液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定飼料中鹽酸克 倫特羅、萊克多巴胺、沙丁胺醇、苯乙醇胺A[J].化學分析計 量,201221(1)：37.39.