孫小杰，王玉梅，劉 真，姜 星

(南京市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)院，江蘇南京 211198)

摘 要：目的：建立免疫親和柱-液質(zhì)聯(lián)用法測(cè)定餅干中赭曲霉毒素A的分析方法。方法：樣品經(jīng)80%甲醇水溶液提取，提取液經(jīng)免疫親和柱凈化，并聯(lián)合液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)餅干中的赭曲霉毒素A進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果：赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性相關(guān)系數(shù)大于0.99，方法的定量限為1.0 µg/kg。樣品的加標(biāo)回收率為89.61%～105.7%，測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于7.26%(=6)。結(jié)論：該方法具有快速，定量準(zhǔn)確，線性相關(guān)性理想，可適用于餅干中赭曲霉毒素A的測(cè)定。

關(guān)鍵詞：液質(zhì)聯(lián)用;免疫親和柱;赭曲霉毒素A

赭曲霉毒素是真菌毒素之一，是由純綠青霉、赭曲霉及碳黑曲霉等產(chǎn)毒菌株污染糧食、食品、飼料及其他農(nóng)副產(chǎn)品后所產(chǎn)生的一種有毒代謝產(chǎn)物，有A、B、C、D4種化合物，其中毒性最大的是赭曲霉毒素A[1]。赭曲霉毒素A對(duì)動(dòng)物和人的毒性主要有腎臟毒、肝毒、致畸、致癌、致突變和免疫抑制作用[2]。為了保障人們的身體健康，《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量》(GB 2761—2017)規(guī)定了谷物及其制品中赭曲霉毒素A的限量為5.0 µg/kg[3]。

2021年4月，食品和快速預(yù)警系統(tǒng)通報(bào)出口至我國(guó)的薄脆餅干中赭曲霉毒素A含量不合格，目前文獻(xiàn)報(bào)道的赭曲霉毒素A的測(cè)定方法主要涉及糧食及其制品、咖啡、酒[4-6]，針對(duì)餅干中赭曲霉毒素A測(cè)定技術(shù)的研究較少。因此有必要建立餅干中赭曲霉毒素A的方法，為餅干中赭曲霉毒素A的含量測(cè)定提供技術(shù)支撐。

1　試驗(yàn)部分

1.1　主要儀器與試劑

液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀：Agilent 1260 HPLC-6470型，配有電噴霧離子源，美國(guó) Agilent公司;電子天平：XS205型，瑞士Metler-Toledo公司;固相萃取裝置：Wat200609，美國(guó)Waters公司;免疫親和柱：3 mL,青島普瑞邦生物工程有限公司;氮吹儀：N-EVAP，美國(guó)Organomation公司;離心機(jī)：ROTINA 35，德國(guó)Hettich公司。

甲醇、乙腈、甲酸：色譜純，美國(guó)ROE公司;甲酸銨、冰乙酸、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸氫鈉、磷酸二氫鉀、氯化鉀、吐溫20：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司;赭曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司;實(shí)驗(yàn)室用水為經(jīng)Mili-Q凈化系統(tǒng)(0.22 µm過(guò)濾膜)過(guò)濾的超純水;真菌毒素清洗緩沖液：先將12.5 g氯化鈉、2.5 g碳酸氫鈉溶于約250 mL水中，加入0.05 mL吐溫20，用水定容至500 mL;磷酸鹽緩沖液：先將4.0 g氯化鈉、0.6 g磷酸氫鈉、0.1 g磷酸二氫鉀、0.1 g氯化鉀溶于約490 mL水中，用濃鹽酸調(diào)節(jié)pH至7.0，用水定容至500 mL。

1.2　標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

(1)赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。稱取赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)品1.0 mg，用乙腈-甲醇溶液(50+50)溶解并定容至100 mL，配成10 µg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-20 ℃保存。

(2)赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)工作液。準(zhǔn)確移取一定量的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用空白樣品提取液稀釋，分別配成0.5 ng/mL、1 ng/mL、5 ng/mL、10 ng/mL和20 ng/mL的基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，4 ℃保存。

1.3　色譜-質(zhì)譜條件

色譜柱：Eclipse plus-C18色譜柱(2.1 mm×100 mm，3.5 µm，美國(guó)agilent公司);柱溫30 ℃;流速：0.2 mL/min;進(jìn)樣量：20 µL;流動(dòng)相：A為5 mmol/L甲酸銨水溶液(含有0.1%甲酸)，B為95%乙腈水溶液(含有0.1%甲酸);梯度洗脫程序?yàn)椋?～2 min，35%～95% B;2～7 min，95% B;7～7.1 min，95%～35% B;7.1～12min，35% B。

1.4　樣品處理

1.4.1　樣品提取

稱取粉碎均勻的試樣25.0 g，加入100 mL甲醇-水溶液(80+20)，高速均質(zhì)5 min后用定量濾紙過(guò)濾，準(zhǔn)確移取4 mL濾液于離心管中，加入26 mL磷酸鹽緩沖液后混勻，混合液備用。

1.4.2　樣品凈化

將免疫親和柱連接于20 mL玻璃注射器下，將混合液分兩次注入玻璃注射器中。調(diào)節(jié)流速約1 滴/s，直至空氣進(jìn)入親和柱中，依次用真菌毒素清洗緩沖液10 mL、水10 mL連續(xù)淋洗親和柱，調(diào)節(jié)流速1～2 滴/s，棄去全部流出液，抽干親和柱。加入1.5 mL甲醇，調(diào)節(jié)流速約為1 滴/s，用試管收集全部洗脫液，在45 ℃下水浴，氮?dú)獯蹈?，?00 µL

流動(dòng)相溶解，供檢測(cè)用。

2　結(jié)果與討論

2.1　提取溶劑的選擇

以甲醇-水溶液(80+20)與乙腈-水溶液(60+40)作為提取溶劑，結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩種提取溶劑的回收率都能達(dá)到90%以上，但考慮到乙腈的毒性，選擇甲醇-水溶液(80+20)作為提取溶劑。

2.2　基質(zhì)效應(yīng)、線性方程與定量限

采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線與溶劑標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的斜率比來(lái)評(píng)價(jià)基質(zhì)效應(yīng)，斜率比為11.9，餅干基質(zhì)對(duì)赭曲霉毒素A具有基質(zhì)增強(qiáng)效應(yīng)，因此采用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行定量分析。赭曲霉毒素A在0.5～20.0 ng/mL濃度范圍內(nèi)，標(biāo)準(zhǔn)溶液的質(zhì)量濃度與色譜峰面積呈良好的線性關(guān)系(r≥0.992 3)，線性方程為y=7 166.18x-474.81，以信噪比為S/N≥10時(shí)確定定量限為1.0 µg/kg，歐盟規(guī)定餅干中赭曲霉毒素A限量值為3.0 µg/kg，因此，方法定量限滿足檢測(cè)的需求。

2.3　方法回收率與精密度試驗(yàn)

通過(guò)向陰性樣品中添加1.0 µg/kg、3.0 µg/kg、10.0 µg/kg3個(gè)濃度水平的赭曲霉毒素A標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行方法回收率和精密度試驗(yàn)，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，赭曲霉毒素A的回收率在89.61%～105.7%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為3.69%～7.26%，符合GB/T 27404—2008中檢測(cè)方法確認(rèn)的要求。

3　結(jié)論

對(duì)餅干進(jìn)行前處理，然后采用液質(zhì)聯(lián)用法對(duì)赭曲霉毒素A進(jìn)行測(cè)定，從而建立了餅干中赭曲霉毒素A測(cè)定的檢測(cè)方法。本方法簡(jiǎn)便準(zhǔn)確，實(shí)用性強(qiáng)，可為餅干中赭曲霉毒素A風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)提供可靠的技術(shù)支持。

參考文獻(xiàn)

[1]PETZINGER E,ZIEGLER K.Ochratoxin A from a toxicological perspective[J].Journal of Veterinary Pharmacology Therapeutics,2010,23(2):91−98.

[2]REDDY L,BHOOLA K.Ochratoxins-food contaminants: impact on human health[J].Toxins,2010,2(4):771-779.

[3]國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì),國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中真菌毒素限量:GB 2761—2017[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2017.

[4]呂相征,謝妮,李業(yè)鵬,等.用高效液相色譜法測(cè)定糧食樣品中的赭曲霉毒素A[J].中國(guó)醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2002(4):47-48.

[5]樊祥,禇慶華,周瑤,等.液-液萃取結(jié)合免疫親和柱層析凈化-高效液相色譜測(cè)定烘焙咖啡中赭曲霉毒素A[J].理化檢驗(yàn)(化學(xué)分冊(cè)),2008(8):736-739.

[6]楊超,林洪,張輝珍,等.免疫親合柱凈化高效液相色譜檢測(cè)啤酒中赭曲霉毒素A[J].食品與發(fā)酵工業(yè),2007(12):127-129.