□ 王曉燕 諾安實(shí)力可(寧波公司)

　　摘 要：本文建立了奶粉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧殘留量檢測(cè)的HLB固相萃取凈化-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法。奶粉經(jīng)乙腈-水提取，正己烷除脂，經(jīng)HLB固相柱凈化后供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀檢測(cè)。奶粉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧的檢出限為10μg/kg，定量限為20μg/kg，頭孢喹肟，頭孢匹羅的檢出限為20μg/kg，定量限為40μg/kg。采用基質(zhì)匹配法對(duì)以上7種頭孢菌素奶粉添加樣品進(jìn)行定量，在添加濃度水平為20μg/kg～200μg/kg范圍內(nèi)，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧的回收率為62%～90%，RSD為3%～11%。在添加濃度水平40μg/kg～200μg/kg范圍內(nèi)，頭孢喹肟，頭孢匹羅的回收率為67%～85%，RSD為5%～10%。該方法準(zhǔn)確度和精密度性能良好，適用于奶粉中上述7種頭孢菌素的多殘留檢測(cè)。

　　關(guān)鍵詞：奶粉 頭孢氨芐 頭孢匹林 頭孢唑啉 殘留

　　頭孢菌素是由冠頭孢菌培養(yǎng)液中分離出的頭孢菌素C，經(jīng)半合成制得的一類β-內(nèi)酰胺類抗生素。該類抗生素的抗菌作用機(jī)制為其可抑制細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽合成酶，影響細(xì)菌細(xì)胞壁黏肽合成，使細(xì)菌細(xì)胞壁缺損，水分由外環(huán)境不斷進(jìn)入高滲的菌體內(nèi)，導(dǎo)致菌體在無細(xì)胞壁約束的情況下不斷膨脹裂解死亡[1]。頭孢菌素抗生素品種繁多且不斷更新，典型的有頭孢氨芐、頭孢匹林、 頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧、頭孢拉定、頭孢呋辛、頭孢曲松、頭孢哌酮等。

　　頭孢菌素抗生素目前主要用于治療革蘭氏菌如葡萄球菌、肺炎球菌、鏈球菌、大腸桿菌、嗜血桿菌、沙門氏菌等引起的各種感染[2]。在畜牧業(yè)中常用來控制奶牛乳房炎[3～5],治療動(dòng)物尿道、胃腸道和呼吸道等感染。在防止動(dòng)物疾病的過程中，由于人為使用方法不當(dāng)或不遵守休藥期規(guī)定等原因，易造成頭孢菌素抗生素在動(dòng)物產(chǎn)品中的殘留，然后通過食物鏈的傳遞富集，給人類健康帶來嚴(yán)重危害，主要體現(xiàn)在對(duì)人體腎臟和肝臟功能的損害[6]，產(chǎn)生過敏反應(yīng)可致皮疹、蕁麻疹、哮喘、藥熱、血清病樣反應(yīng)、血管神經(jīng)性水腫、過敏性休克等，導(dǎo)致胃腸道反應(yīng)和胃腸道菌群失調(diào)，細(xì)菌耐藥性等[7]。為此，歐盟、中國、美國、日本等國家已對(duì)動(dòng)物源食品中頭孢菌素抗生素殘留量做出了最大殘留限量值的規(guī)定，牛奶中的限量要求一般為0.01～0.1mg/kg之間，最嚴(yán)格的頭孢洛寧為0.01mg/kg。

　　目前，頭孢菌素殘留的常規(guī)檢測(cè)方法有微生物法、熒光法、液相色譜-紫外法、液相色譜-質(zhì)譜法等,多為單項(xiàng)檢測(cè)或少數(shù)幾種頭孢菌素的多殘留檢測(cè)。本文針對(duì)頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧7種頭孢菌素類抗生素建立了一種專屬性強(qiáng)、靈敏度高和分析時(shí)間短的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(UPLC-MS/MS)方法，以保障對(duì)動(dòng)物源性食品中該類藥物殘留的確證檢測(cè)。

　　1 材料和方法

　　1.1 儀器設(shè)備

　　Waters Xevo TQD;分析天平(感量0.00001g);天平(感量0.01g);高速冷凍離心機(jī);渦旋混合器;水平振蕩器;固相萃取裝置;Waters HLB固相萃取柱(500mg/6mL);氮吹儀;濾膜(0.22μm)。

　　1.2 試劑和標(biāo)準(zhǔn)品

　　乙腈、甲醇、正己烷均為HPLC級(jí); 磷酸氫二鉀、氫氧化鉀、氯化鈉均為分析純;頭孢喹肟、頭孢唑啉、頭孢匹林、頭孢氨芐、頭孢洛寧、頭孢噻呋、頭孢匹羅，純度均>98%。

　　0.05mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PH=8.5):稱取8.7g磷酸氫二鉀，超純水溶解，稀釋至1000mL，調(diào)PH至8.5±0.1。

　　標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液(1000mg/L)：準(zhǔn)確稱取適量的頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢喹胿、頭孢匹羅、頭孢洛寧，用乙腈-水溶液溶解稀釋，分別配制成1000mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，-10℃下保存，有效期為1年。

　　混合標(biāo)準(zhǔn)工作液(5mg/L)：分別準(zhǔn)確吸取適量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用乙腈-水溶液配置成5mg/L的標(biāo)準(zhǔn)工作液，4℃下保存，有效期為1周。

　　1.3.樣品的提取與凈化

　　1.3.1提取

　　稱取0.5g奶粉試樣(精確到0.01g)置于50mL離心管中，加入4.0mL水，使奶粉充分溶解，加入25mL乙腈+水(15+2)，用均質(zhì)器均質(zhì)1min，于10℃、9500r/min條件下離心10min，取出上清液。

　　1.3.2凈化

　　準(zhǔn)確移取20.0mL提取液至離心管中,加入10mL乙腈飽和正己烷振蕩1min，靜置，棄掉正己烷，于40℃條件下氮吹至近干。用10mL磷酸鹽緩沖溶液溶解殘?jiān)?渦旋混勻,用0.1moL/L氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至8.5，然后以1mL/min的流速上樣HLB柱。先用2mL磷酸鹽緩沖溶液淋洗2次，再用1mL純水淋洗，棄去全部流出液。用3mL乙腈洗脫,收集洗脫液于15mL玻璃試管中,于40℃條件下氮吹近干，用純水定容至2mL，混勻后，過0.22μm濾膜，供超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀定。

　　1.3.3 測(cè)定

　　液相色譜條件：色譜柱：Waters AQ BEH C181.7μm,2.1mmx100mm;流動(dòng)相：A:0.1%乙酸水溶液 B:乙腈;流速：0.2 mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：5μL。

　　質(zhì)譜條件：電噴霧離子源;正離子掃描;多反應(yīng)選擇離子檢(MRM);毛細(xì)管電壓為3kV;霧化氣溫度500℃;去溶劑氣流速800L/hr。

　　2. 結(jié)果與討論

　　2.1.提取和凈化過程對(duì)回收率的影響

　　奶粉中含有脂肪、蛋白質(zhì)、乳糖、無機(jī)離子等成分，理想的提取和凈化過程不僅可以有效去除干擾物質(zhì)，得到可靠的定性結(jié)果，同時(shí)又不會(huì)對(duì)目標(biāo)分析物造成過多的損失，得到準(zhǔn)確的定量結(jié)果。本試驗(yàn)分別考察了乙腈+水(15+2)提取過程，乙腈飽和正己烷去脂過程和HLB-SPE固相萃取凈化過程對(duì)奶粉中7種頭孢分析物回收率結(jié)果的影響，見表2.1。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn):乙腈飽和正己烷凈化過程和HLB-SPE固相萃取凈化過程對(duì)奶粉中7種頭孢類分析物的回收率均達(dá)85%以上，僅乙腈+水(15+2)提取過程對(duì)頭孢氨芐的提取效果較差，回收率不足60%，說明該試劑對(duì)頭孢氨芐的提取效率較低。因此，需要對(duì)頭孢氨芐的提取試劑進(jìn)行優(yōu)化。

　　2.2.濃縮方式的選擇

　　有機(jī)試劑提取后需要對(duì)20mL樣品提取液進(jìn)行濃縮至近干。為了提高濃縮效率，同時(shí)降低濃縮過程對(duì)7種頭孢分析物的影響，本試驗(yàn)分別考察了旋蒸，氮吹，旋蒸后氮吹3種方式的濃縮效果，見表2.2。

　　結(jié)果發(fā)現(xiàn)，40℃條件進(jìn)行旋蒸濃縮，頭孢氨芐損失明顯，回收率不足30%，頭孢洛寧的回收率也不足80%;40℃條件下進(jìn)行氮吹濃縮，7種頭孢菌類分析物的回收率在70%～110之間;40℃條件下先旋蒸，再氮吹至近干，7種頭孢類分析物的回收率在80%～100%之間。因此，綜合考慮工作效率和回收率結(jié)果，本實(shí)驗(yàn)選擇40℃條件下氮吹至近干的濃縮方式。

　　2.3.方法驗(yàn)證參數(shù)

　　2.3.1 線性

　　用奶粉空白基質(zhì)溶液分別配制濃度水平為2，5，10，20，50，100μg/L的頭孢菌素標(biāo)準(zhǔn)工作校正曲線，驗(yàn)證該方法的線性范圍。如表2.3所示，在2～100μg/L濃度范圍內(nèi)7個(gè)頭孢菌素基質(zhì)匹配校正曲線的相關(guān)系數(shù)R2均大于0.99。

　　2.3.2 靈敏度

　　按1.3節(jié)方法處理奶粉樣品，以S/N≥3確定檢出限(LOD)，以S/N≥10確定定量限(LOQ)。如表2.3所示，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧在奶粉中的檢出限(LOD)為10μg/kg，定量限(LOQ)為20μg/kg，頭孢喹肟、頭孢匹羅在奶粉中的檢出限(LOD)為20μg/kg，定量限(LOQ)為40μg/kg。

　　2.3.3 回收率和精密度

　　用奶粉空白樣品分別制備濃度水平為20μg/kg，40μg/kg，80μg/kg，200μg/kg的添加樣品，每個(gè)水平制備3個(gè)平行樣品，用基質(zhì)匹配校正曲線計(jì)算添加目標(biāo)物的回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。如表2.3所示，在20～200μg/kg濃度范圍內(nèi)，頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、頭孢洛寧的回收率為62%～90%，RSD為3%～11%，在該濃度范圍內(nèi)可以準(zhǔn)確定量。在40～200μg/kg濃度范圍內(nèi)，頭孢喹肟，頭孢匹羅的回收率為67%～85%，RSD為5%～10%。

　　3. 結(jié)論

　　本文建立了HLB固相萃取凈化-超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)奶粉中頭孢氨芐、頭孢匹林、頭孢唑啉、頭孢噻呋、 頭孢喹肟、頭孢匹羅、頭孢洛寧7種頭孢菌素殘留量的方法。本方法準(zhǔn)確度和精密度良好，適用于奶粉中上述7種頭孢菌素殘留量的檢測(cè)。

　　參考文獻(xiàn)

　　[1] 劉世良.抗菌藥物作用機(jī)制的研究[J].中外醫(yī)療,2012(4);35.

　　[2] 中國獸藥典委員會(huì).中國獸藥典[M].北京：化學(xué)工業(yè)出版，2005.

　　[3] Bryan MA，HeuerC，Emslie FR.New Zeal Vet J，2011.59(4):166.

　　[4] Shephard RWBurmanS,Marcun P.Aust Vet J，2004，82(10):624.

　　[5] McDougall S.New Zeal Vet J，2010，58(1) : 45.

　　[6] 白國濤,儲(chǔ)曉剛，潘國卿等.色譜.2009，27(4):417.

　　[7] 陳號(hào)，彭開松，朱良強(qiáng)等.動(dòng)物源食品中內(nèi)酰胺類藥物殘留分析方法的研究進(jìn)展[J].中國獸藥雜志，2008，42(5)：42-45.