高效液相色譜串聯(lián)質譜法檢測豆芽中的6-芐基腺嘌呤含量

2016-08-23 17:27:52 來源：食品安全導刊

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6-芐基腺嘌呤(6-benzylaminopurine，6-BA)是一種人工合成的細胞分裂素，與植物內源性激素具有相似的結構及性質，為一種植物生長調節(jié)劑[1]。如果人體攝入過量會刺激皮膚黏膜，出現(xiàn)食道和胃黏膜損傷、惡心、嘔吐等癥狀。目前，測定豆芽中6-BA的方法主要有高效液相色譜法、液相色譜-大氣壓化學源質譜法及液相色譜—串聯(lián)質譜法[2-4]等。本研究采用LC-MS/MS法來測定豆芽中的6-BA，提取試劑為酸化甲醇，以乙腈及水(含0.1%甲酸)為流動相進行梯度洗脫，經過反相色譜分離后以多反應監(jiān)測方式進行檢測。
　　材料和方法
　　儀器 API 4000型三重四極桿串聯(lián)質譜儀，LC-20A液相色譜儀(包括二元輸液泵及自動進樣器)。藥品及試劑 6-BA標準品(含量97.0%),甲醇、乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。
　　標準儲備溶液精密稱取6-BA 0.1000g于100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，作為標準儲備溶液。此標準儲備溶液每毫升相當于1.0mg 6-BA。
　　色譜柱：Symmetry C18柱，3.5m，150×2.1mm I.D.，waters公司;流動相：乙腈-水(含0.1%甲酸);流速：0.25 mL/min;柱溫：25℃;進樣量：10μL。梯度洗脫條件見表1。

　　質譜條件采用電噴霧離子化源;離子噴射電壓：5500V;溫度：500℃;源內氣體1(GS1，N2)壓力：55psi;氣體2(GS2，N2)壓力：55psi;氣簾氣體(N2)壓力：15psi;正離子方式檢測;6-BA的解簇電壓(DP)為70V，碰撞能量(CE)為80eV;用于定量分析的離子反應為m/z 226.2→m/z 64.9，6-BA結構及[M+H]+的產物離子掃描質譜圖見圖1。

　　圖1 6-BA的結構及[M+H]+的產物離子掃描質譜圖

　　豆芽樣品的預處理稱取豆芽樣品500g用食物粉碎機粉碎后，取5g樣品(精確至0.01g)于50mL聚丙烯離心管中，加入10mL酸化甲醇(每100mL甲醇中加入乙酸100μL，混勻)，用均質機勻質3min，超聲提取3min，1,2000rpm離心10min，上清液轉入25mL容量瓶中，樣品再用10mL酸化甲醇重復提取一次。合并上清液，用水定容至刻度，搖勻，取部分液體經0.45μm濾膜過濾，供LC-MS/MS分析。
　　空白豆芽萃取液制備選擇在生產過程中未添加6-BA的豆芽。按1.6試樣處理方法提取，經0.45μm有機濾膜過濾?？蛇M行LC-MS/MS分析，以確定在6-BA出峰處不存在干擾。
　　結果與討論
　　色譜行為和專屬性　按“豆芽樣品的預處理”操作, 分別制備空白豆芽樣品、空白豆芽加入6-BA標準溶液(相當于含15μg/kg6-BA的豆芽樣品)進行測試。典型色譜圖分別見圖2-A和圖2-B。結果表明：空白豆芽中的內源性物質不干擾6-BA的測定。

　　圖2 測定豆芽中6-BA的典型MRM色譜圖

　　線性范圍和靈敏度取空白豆芽萃取液，依次加入適量6-BA標準系列溶液，配制成相當于豆芽濃度為2.5、5、15、45和100μg/kg的豆芽樣品萃取液，按“豆芽樣品的預處理”項下操作，記錄色譜圖;以待測物濃度為橫坐標，待測物峰面積為縱坐標，進行回歸運算，求得的直線回歸方程即為標準曲線(y=1.35e+004x+2.58e+003，r =0.9983)。結果表明6-BA在2.5～100μg/kg范圍內線性良好，方法檢出限為1μg/kg(信噪比S/N=3)。
　　回收率和精密度試驗分別制備了相當于含6-BA 5、15和100μg/kg的低、中、高3個濃度豆芽樣品，按1.6項的操作方法進行處理，每濃度六樣本分析，并與標準曲線同時進行，以當時的標準曲線計算樣品的測得濃度，求得本法的精密度與回收率。低、中、高3個濃度的回收率范圍分別為90%～98%、92%～101%和91%～102%，精密度分別為4.5%、5.6%和8.9%，結果均符合相關要求。
　　質譜條件優(yōu)化將濃度為100ng/mL的6-BA標準溶液吸入注射器中，放置于蠕動泵進樣器上，以20µL/min的速度進樣，對質譜條件進行優(yōu)化，盡量使待測物響應信號最高化。在實驗過程中比較了6-BA在正、負兩種離子化方式的響應值，發(fā)現(xiàn)正離子化效率高于負離子化效率，正離子響應較為穩(wěn)定，因此選擇了正離子掃描方式。
　　經過Q1全掃描，選擇了響應信號最高的m/z 226.2作為6-BA分析的母離子，在MS2掃描方式下，找到一些碎片離子，其中m/z 91.0響應最高，m/z 64.9次之，在多反應監(jiān)測掃描方式下，m/z 226.2→m/z 91.0離子對響應信號較高，但干擾較大，故選擇m/z 226.2→m/z 64.9用于6-BA的定量分析。在MRM模式下，在蠕動泵持續(xù)進樣的情況下，對各項質譜參數(shù)進行優(yōu)化，使得待測物響應值達到最高。
　　色譜條件優(yōu)化雖然質譜專屬性高，但將樣品中的內源性物質與待測物進行分離還是必要的，以減少對測定的干擾，所以對色譜條件進行了選擇及優(yōu)化。
　　6-BA在小粒徑的C18色譜柱上都有較好的保留，所以選擇了實驗室常用的Symmetry C18柱(3.5μm，150×2.1mm I.D.)。應用反相色譜條件時，LC-MS/MS分析方法應用的有機相主要為乙腈和甲醇，選用乙腈時，6-BA的色譜行為較好。試驗中發(fā)現(xiàn)甲酸的加入會抑制6-BA的信號，但考慮到能夠使待測物與內源性物質充分分離，并且能夠改善峰形，所以選擇了0.1%的甲酸作為水相。
　　提取條件的選擇試驗中考察了以下幾種提取試劑，包括甲醇、酸化甲醇和乙酸乙酯，結果發(fā)現(xiàn)酸化甲醇的提取效率要高于另外兩種試劑，而超聲提取的使用同樣會提高待測物的提取效率，所以最終選擇了用酸化甲醇作為提取試劑，進行超聲提取。
　　本研究采用高效液相色譜-串聯(lián)質譜法來檢測豆芽中的6-芐基腺嘌呤含量，方法采用多反應監(jiān)測進行定量，排除了內源性物質干擾，提高了專屬性。該法靈敏度高、準確可靠，檢出限達到1μg/kg，前處理方法簡單，有較強的實際應用價值。
　　沈陽食品檢驗所
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