食品微生物快速檢測技術(shù)研究

2018-04-24 13:23:58 來源：食品安全導(dǎo)刊

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　　為保障食品安全，減少食源性疾病的發(fā)生，食源性致病菌的檢測顯得尤為關(guān)鍵。傳統(tǒng)的微生物檢驗(yàn)方法主要基于培養(yǎng)法，一般流程為：樣品均質(zhì)，增菌，選擇性分離，生化鑒定及血清學(xué)鑒定。其優(yōu)點(diǎn)是靈敏度高、價(jià)格低廉、容易操作，缺點(diǎn)是勞動(dòng)量大且檢驗(yàn)周期長。隨著技術(shù)的發(fā)展，無需增菌，直接檢測食品樣品中低濃度的致病菌已成為可能。這些不依賴于培養(yǎng)、新型、快速的檢測技術(shù)可以有效分離、聚集和鑒別致病菌，從而縮減了整個(gè)檢驗(yàn)周期。

　　核酸檢測技術(shù)

　　基于PCR的檢測技術(shù)

　　普通PCR PCR技術(shù)被廣泛用于各類食品中致病菌及毒素的檢測。介于食品基質(zhì)的影響，常需離心或磁珠法預(yù)處理將致病菌從食品中分離。也有研究使用金屬氫氧化物進(jìn)行微生物的富集分離，Taylor等人使用氫氧化鈦從碎牛肉中分離E.coli O157:H7后，通過對志賀毒素基因II的擴(kuò)增進(jìn)行檢測。

　　多重PCR多重PCR是在一個(gè)反應(yīng)體系中使用多對引物同時(shí)進(jìn)行多個(gè)目標(biāo)擴(kuò)增的PCR反應(yīng)，可同時(shí)檢出多種病原微生物，比普通PCR更加高效、經(jīng)濟(jì)、便捷。使用此技術(shù)，需要對多對引物進(jìn)行精心設(shè)計(jì)，以使其具有相近的退火溫度。每對引物的濃度需要調(diào)整優(yōu)化，否則可能導(dǎo)致引物二聚體生成和非目標(biāo)片段擴(kuò)增。

　　實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）是利用熒光信號的變化，實(shí)時(shí)監(jiān)測PCR反應(yīng)過程中DNA擴(kuò)增產(chǎn)物的方法。使用該方法，無需電泳或進(jìn)行其他后續(xù)分析。最早的qPCR使用SYBR Green熒光染料進(jìn)行熒光信號的測定，此外還有TaqMan探針法、分子信標(biāo)法，他們在準(zhǔn)確性、特異性方面要優(yōu)于染料法。

　　實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR實(shí)時(shí)定量反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-qPCR）也可實(shí)時(shí)監(jiān)測擴(kuò)增的目標(biāo)產(chǎn)物，它先以RNA為模板反轉(zhuǎn)錄cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。RT-qPCR靈敏度較高，樣品制備或擴(kuò)增條件的細(xì)微差異都可能影響結(jié)果。由于RNA在胞外極易降解，故RT-qPCR優(yōu)勢在于僅活細(xì)胞的RNA被提取，結(jié)果假陽性率較低。

　　非PCR核酸檢測技術(shù)

　　環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增法(LAMP)是一種新穎的恒溫核酸擴(kuò)增方法，其特點(diǎn)是針對靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)4種特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶在等溫條件(59-65℃)保溫30～60分鐘，即可完成擴(kuò)增反應(yīng)。與常規(guī)PCR相比，不需要模板的熱變性、溫度循環(huán)等過程，檢測成本低。LAMP特異性強(qiáng)、靈敏度高，其1小時(shí)內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物量可以高出普通PCR的103倍。

　　核酸依賴性擴(kuò)增檢測技術(shù)核酸依賴性擴(kuò)增檢測技術(shù)（NASBA）是一項(xiàng)以RNA模板進(jìn)行等溫核酸擴(kuò)增并能實(shí)時(shí)監(jiān)測結(jié)果的檢測方法。該技術(shù)的檢測反應(yīng)有賴于AMV逆轉(zhuǎn)錄酶、噬菌體T7RNA多聚酶、核糖核酸酶H、兩種特別設(shè)計(jì)的特異性寡核苷酸引物和分子信標(biāo)探針共同協(xié)作而完成。有研究者使用NASBA技術(shù)進(jìn)行牛奶中金黃色葡萄球菌，檢出限分別為1～10cfu/mL。

　　基因芯片基因芯片是一塊載有許多短小DNA探針的特殊玻璃片，探針與目標(biāo)微生物的標(biāo)記基因互補(bǔ)，大小在25～80bp之間。先提取目標(biāo)微生物的DNA，進(jìn)行熒光標(biāo)記、變性后與芯片上的探針進(jìn)行雜交，形成的雙鏈DNA釋放熒光信號，從而得到檢測。

　　微流體芯片微流體技術(shù)是指在微觀尺寸下控制、操作和檢測復(fù)雜流體的技術(shù)，被稱為“芯片實(shí)驗(yàn)室”或“微整合分析芯片”，可將樣品制備、生化反應(yīng)、結(jié)果檢測等步驟集成到生物芯片上，實(shí)驗(yàn)所用流體的量可低至納升或皮升級。Zhang等人使用微流體芯片檢測了面包、牛奶和香蕉中的鼠傷寒沙門氏菌等3種菌的檢測，檢測時(shí)間僅用了14min。

　　免疫學(xué)方法

　　酶聯(lián)免疫法ELISA酶聯(lián)免疫法ELISA是應(yīng)用最廣泛的致病菌檢測方法之一。近期該方法的研究進(jìn)展集中在如何提高抗體的密度以提高方法的靈敏度或新抗體的開發(fā)等。Chunglok等人使用單層的碳納米管作為抗固定化載體，檢測了牛奶中的鼠傷寒沙門氏菌，檢出限比其他免疫學(xué)方法低了2個(gè)log值。

　　側(cè)向流免疫層析側(cè)向流層析技術(shù)以大孔徑的微孔濾膜為載體，先將特異性的抗原或抗體固定在濾膜上，樣品通過時(shí)發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，用免疫膠金體或免疫酶染色得到直觀的顯色結(jié)果。此技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)是成本低、穩(wěn)定性好、技術(shù)難度小、檢驗(yàn)時(shí)間短等，可用于高通量樣品篩選，但假陽性率比ELISA和PCR高。

　　生物傳感器常見的用于檢測致病菌的生物傳感器包括光學(xué)傳感器、電化學(xué)傳感器、壓電式傳感器、磁彈性傳感器。近些年，生物傳感器的靈敏度、特異性和速率不斷提升，但依然存在重現(xiàn)性差和現(xiàn)場檢測應(yīng)用方面的問題，新的傳導(dǎo)材料的開發(fā)，多重檢測、微流體技術(shù)與傳感器的耦合，及無線設(shè)備的研發(fā)等將是這一領(lǐng)域的發(fā)展方向。

　　隨著技術(shù)的發(fā)展，許多新型、快速的致病菌檢測方法得到了開發(fā)和應(yīng)用。核酸檢測技術(shù)的檢測快速、專一性強(qiáng)，可重復(fù)使用，所需DNA樣本量少，qPCR、LAMP和NASBA是其中的重要檢測技術(shù)。ELISA和LFI技術(shù)無需提取DNA步驟，但靈敏度有待提高，多重檢測和自動(dòng)化操控也在研究之中。生物傳感器分析迅速、操作簡單，不同的傳感元件、傳導(dǎo)技術(shù)被開發(fā)用于食品致病菌的檢測。這些方法作為傳統(tǒng)方法的替代性方法，大大縮減了檢驗(yàn)周期。高效快速分離方法的研究、特異性探針的開發(fā)，以及對新方法進(jìn)行綜合性的驗(yàn)證能夠促進(jìn)這些技術(shù)更成熟的發(fā)展。

　　李璐太原市食品藥品檢驗(yàn)所