正交試驗設計在優(yōu)化釀酒酵母 培養(yǎng)條件中的應用
摘要：本文以優(yōu)化釀酒酵母培養(yǎng)條件為例，詳細闡述了正交試驗設計的應用過程，包括正交試驗設計中的具體環(huán)節(jié)如：定指標、選因素、定水平、列因素水平表、選正交表等。具體采用了L9(33)正交表對影響釀酒酵母生長的關鍵因素：培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度和搖床轉速進行了正交試驗設計，同時詳細闡述了如何對試驗結果進行方差分析和極差分析。
關鍵詞：正交試驗設計；優(yōu)化；培養(yǎng)條件；釀酒酵母
Abstract:In this paper,to optimize the culture conditions of Saccharomyces cerevisiae as an example,the application process of orthogonal experiment design is described in detail.The specific links of orthogonal experiment design are as follows:setting indicators,factoring,setting level,column factor table,choosing the orthogonal table and so on.Adopting the L9(33)orthogonal table on the growth of Saccharomyces cerevisiae including:the incubation time,the culture temperature and the rotational speed of the shaker were investigated by orthogonal test.At the same time,the variance analysis and the analysis of the results were analyzed in detail.
Key words:orthogonal experiment design;optimization;culture conditions;Saccharomyces cerevisiae.
釀酒酵母也稱出芽酵母或面包酵母，為革蘭氏染色陽性菌，單細胞，球形、橢圓形(3~8μm)或細胞延伸呈退化型假菌絲。近幾年來，釀酒酵母作為模式生物在基因工程領域也發(fā)揮了較大作用，人們利用釀酒酵母生產(chǎn)大量的重組蛋白及生物藥品，并取得一定的進展[1]。這些成果皆是以發(fā)酵獲得高細胞濃度的酵母為基礎進行研究而取得的，國內(nèi)外對于釀酒酵母發(fā)酵領域的研究已有較多報道。
正交試驗設計是利用正交表來安排與分析多因素試驗的一種設計方法。它是由試驗因素的全部水平組合中，挑選部分有代表性的水平組合進行試驗的，通過對這部分試驗結果的分析了解全面試驗的情況，找出最優(yōu)的水平組合。正交試驗在不影響試驗效果的前提下，設計用較少的試驗次數(shù)，取得較為準確、可靠的優(yōu)選結論，大大提高了試驗的效率。
本文將采用正交試驗設計探討在多因素多水平條件下如何優(yōu)化釀酒酵母的培養(yǎng)條件，以期獲得高細胞濃度的酵母。
1.正交試驗方案設計
1.1指標
本實驗以釀酒酵母菌液的吸光值（600 nm處）為指標，指標越大越好。指標越大，表明釀酒酵母液密度越大即釀酒酵母生長越好。
1．基金項目：本文系瀘州職業(yè)技術學院院級課題《濃香型白酒發(fā)酵溫度及發(fā)酵時間對雜醇油含量影響的初步研究》（項目編號：K-1718），川酒文化國際傳播研究中心規(guī)劃項目《互聯(lián)網(wǎng)+川酒文化國際傳播策略研究》（項目編號：CJCB2017-14）階段性成果。
2．作者簡介：潘玲玲（1988-），女，四川綿陽人，助教，碩士。主要研究方向食品工程與釀造科學。
1.2選因素
釀酒酵母培養(yǎng)的時間、溫度和轉速這3個因素對其細胞密度影響較大，因此選擇這三個因素進行試驗。
1.3定水平
單因素實驗確定釀酒酵母生長的最佳培養(yǎng)時間、溫度和轉速。為了詳細闡述我們假設單因素實驗結果為最佳培養(yǎng)時間27h，最佳培養(yǎng)溫度28℃，最佳轉速為150(r/min)。同時依據(jù)單因素試驗后數(shù)據(jù)分析，假設選定較優(yōu)培養(yǎng)時間為25 h、27 h、29 h；較優(yōu)培養(yǎng)溫度為27℃、28℃、29℃；較優(yōu)搖床轉速為150r/min、160r/min、170 r/min。
1.4列因素水平表
酵母培養(yǎng)條件的正交實驗設計以上文得出的較優(yōu)數(shù)據(jù)為相應因素的三個水平，三因素即培養(yǎng)時間、培養(yǎng)溫度、搖床轉速，分別記作A、B、C，進行三因素三水平的正交試驗，對培養(yǎng)條件進一步優(yōu)化。因素水平表如表1所示。
表1
水平
因素培養(yǎng)時間/h
A培養(yǎng)溫度/℃
B搖床轉速
C/(r/min)
1 25 27 150
2 27 28 160
3 29 29 170
1.5選擇合適的正交表
一般情況下，試驗因素的水平數(shù)應等于正交表中的水平數(shù)；因素個數(shù)應不大于正交表的列數(shù)；各因素的自由度之和小于所選正交表的總自由度，以便估計試驗誤差。若各因素及交互作用的自由度之和等于所選正交表總自由度，則可采用有重復正交試驗來估計試驗誤差[2]。
正交表選擇依據(jù)：
列：正交表的列數(shù)c≥因素所占列數(shù)+交互作用所占列數(shù)+空列。
自由度：正交表的總自由度（a-1）≥因素自由度+交互作用自由度+誤差自由度。
本試驗有3個因素三個水平，且不考慮因素間的交互作用，依據(jù)以上原則，試驗的次數(shù)應該為9次，故宜選用L9（33）正交表。
2.正交試驗方案
按下列正交試驗方案分別進行試驗，記錄試驗結果（見表2）。為方便數(shù)據(jù)分析，正交試驗結果假設為y1、y2、y3、y4、y5、y6、y7、y8和y9。（本試驗沒有涉及交互作用）
3.試驗結果分析（確定試驗因素的優(yōu)水平和最優(yōu)水平組合）
3.1直觀分析法---極差分析法
直觀分析法對試驗結果分析的優(yōu)點是簡單、直觀、易做，計算量較少。
表2
試驗號A B C試驗結果
?。∣D600）
1 1 1 1 y1
2 1 2 2 y2
3 1 3 3 y3
4 2 1 2 y4
5 2 2 3 y5
6 2 3 1 y6
7 3 1 3 y7
8 3 2 1 y8
9 3 3 2 y9
K1j y1+y2+y3 y1+y4+y7 y1+y6+y8
K2j y4+y5+y6 y2+y5+y8 y2+y4+y9
K3j y7+y8+y9 y3+y6+y9 y3+y5+y7
k1j(y1+y2+y3)/3(y1+y4+y7)/3(y1+y6+y8)/3
k2j(y4+y5+y6)/3(y2+y5+y8)/3(y2+y4+y9)/3
k3j(y7+y8+y9)/3(y3+y6+y9)/3(y3+y5+y7)/3
R RA=kAmax-kAmin RB=kBmax-kBmin RC=kCmax-kCmin
優(yōu)組合
第一步：算
Kij i表水平數(shù)，j表因素
K1A表示A因素第一個水平下試驗值之和。
K2A表示A因素第二個水平下試驗值之和。
K3A表示A因素第三個水平下試驗值之和。
K為第j列因素i水平所對應的試驗指標和，k為各水平所對應的平均值。由k大小可以判斷第j列因素優(yōu)水平和優(yōu)組合。
即是：K1A=y1+y2+y3 K2A=y4+y5+y6 K3A=y7+y8+y9
k1A=K1A/3 k2A=K2A/3 k3A=K3A/3
同理可得：K1B、K2B、K3B、K1C、K2C、K3C
k1B、k2B、k3B、k1C、k2C、k3C
具體計算如表2所示。
第二步：比
同一列中，k值最大者減去最小者所得的差稱為極差，極差計算公式：，具體計算如上表3所示。R為第j列因素的極差，反映了第j列因素水平波動時，試驗指標的變動幅度。R越大，說明該因素對試驗指標的影響越大，本試驗中即是極差越大的，該因素對OD值的影響越大，反之越小。根據(jù)R大小，可以判斷因素的主次順序。假設本例中極差RA＞RC＞RB，則因素主次為A＞C＞B，則表明釀酒酵母的培養(yǎng)時間對OD值影響最大，搖床轉速次之，培養(yǎng)溫度影響最小。
第三步：看
首先找出各因素下最大的那個kij值，然后再比較這三個值，從而找出最優(yōu)組合，假設本例中k3A＞k2A＞k1A，k2C＞k1C＞k3C，k2B＞k3B＞k1B且k3A＞k2C＞k2B，結合因素影響大小，則最優(yōu)水平組合為A3C2B2，則表明釀酒酵母在培養(yǎng)時間為29h、搖床轉速為160(r/min)、培養(yǎng)溫度為28℃時生長狀況最好。
如果試驗號沒有該水平組合，可補充該組合試驗，考察該試驗的OD值是否更好。
3.2方差分析（可判定對指標的影響程度）
極差分析不能將試驗中由于試驗條件改變引起的數(shù)據(jù)波動同試驗誤差引起的數(shù)據(jù)波動區(qū)分開來，即不能區(qū)分因素各水平間對應的試驗結果的差異究竟是由于因素水平不同引起的，還是由于試驗誤差引起的，無法估計試驗誤差的大小。此外，各因素對試驗結果的影響大小無法給以精確的數(shù)量估計，不能提出一個標準來判斷所考察因素作用是否顯著。為了彌補極差分析的缺陷，可采用方差分析。
方差分析基本思想是將數(shù)據(jù)的總變異分解成因素引起的變異和誤差引起的變異兩部分，構造F統(tǒng)計量，作F檢驗，即可判斷因素作用是否顯著[3]。
?。?）計算總離差平方和
且
其中，n代表總共的試驗次數(shù)，yi表示每一次的試驗結果，表示試驗結果的平均數(shù)。
ST反映了試驗結果的總差異，它越大，說明各次試驗的結果之間的差異越大。試驗差異來源于兩部分，第一是由因素水平的變化所引起，二是因為試驗誤差。
（2）計算各因素的離差平方和
即各j列組間平方和，j=1,2,3···
其中m為水平數(shù)，Sj為第j個因素下試驗結果的離差平方和，Kij表示j因素下第i表個水平試驗值之和。
?。?）計算誤差的離差平方和
誤差的方差=誤差的離差平方和/誤差的自由度
?。?）計算自由度
總自由度：dfT=試驗的次數(shù)1=n-1
任一列的自由度（因素的自由度）：dfj=因素的水平數(shù)1=r-1
誤差自由度：dfe=dfT-dfA-dfB-dfC
?。?）計算均方（平均離差平方和）
因素的均方：（A因素的離差平方和/A因素的自由度）
誤差的均方：（誤差的離差平方和/誤差的自由度）
?。?）構造F統(tǒng)計量
將各因素的均方除以誤差的均方，得到F值。
（7）列方差分析表，作F檢驗
按以上計算公式分別計算后，列方差分析表（見表3）。
表3
變異來源平方和自由度均方F值Fa(臨界值)顯著水平
A SA 2 MSA FA=MSA/MSe
B SB 2 MSB FB=MSB/MSe
C SC 2 MSC FC=MSC/MSe
誤差e SE 2 MSe
總和ST
查表可得F0.01(dfA，dfe)、F0.05(dfA，dfe)、F0.10(dfA，dfe)的值，以培養(yǎng)時間為例進行分析。
當FA>F0.01(dfA，dfe)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有高度顯著的影響，記作**；在本例中也就是說培養(yǎng)時間對釀酒酵母的生長有高度顯著地影響。
當F0.01(dfA，dfe)>FA>F0.05(dfA，dfe)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有顯著的影響，記作*；在本例中也就是培養(yǎng)時間對釀酒酵母的生長有顯著的影響。
當F0.05(dfA，dfe)>FA>F0.10(dfA，dfe)時，說明該因子水平的改變，對試驗結果有一定的影響，記作*-；在本例中也就是培養(yǎng)時間對釀酒酵母的生長有一定的影響。
同理可對培養(yǎng)溫度和搖床轉速進行分析，由此可判定培養(yǎng)溫度和搖床轉速對釀酒酵母生長的影響。
（8）驗證試驗結果
經(jīng)正交試驗結果分析可得出最優(yōu)釀酒酵母培養(yǎng)的條件，最后進行最優(yōu)試驗條件的驗證。
4.結論
正交試驗設計在不影響試驗效果的前提下，用較少的試驗次數(shù)了解到全面的試驗情況，優(yōu)化了釀酒酵母的培養(yǎng)條件，以獲得高細胞濃度的酵母，大大提高了試驗效率。
潘玲玲粱麗靜李建華瀘州職業(yè)技術學院
參考文獻：
[1]李聰.釀酒酵母培養(yǎng)條件及發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化[J].中國農(nóng)學通報,2014,(09):302-306.
[2]陳魁，應用概率統(tǒng)計[M].清華大學出版社，2000:280-283.
[3]潘麗軍陳錦權，試驗設計與數(shù)據(jù)處理[M].東南大學出版社,2008.
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