經(jīng)過查閱中外文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)如今提取花青素的原料一般為胡柚、漿果等水果類食物，而較少采用常見的蔬菜紫皮洋蔥來進(jìn)行實驗。此外，目前所使用的常規(guī)提取方法仍較為傳統(tǒng)，而這些方法普遍存在著一些弊端。反之，新型的微波輔助提取法(MAE)具有提取充分、得率高、耗時短等優(yōu)點，從而漸漸受到廣泛重視，其原理為在微波輻射下，樣品中的水分等極性物質(zhì)吸收微波能量，大量產(chǎn)熱，使得細(xì)胞內(nèi)溫度升高迅速，當(dāng)液態(tài)水汽化時產(chǎn)生巨大的壓力將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，從而有利于胞內(nèi)物質(zhì)釋放到提取液中并充分溶解。

　　綜合上述情況，本實驗選取紫皮洋蔥作為原料，使用MAE進(jìn)行輔助提取，并采用析因設(shè)計法來確定最為優(yōu)化的提取條件，同時嘗試對高效液相色譜(HPLC)的洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，為后續(xù)對紫皮洋蔥中花青素的定性和定量實驗做好鋪墊。

　　實驗材料和方法 樣品準(zhǔn)備 從超市購買2公斤紫皮洋蔥，洗凈后切成小塊(5mmX5mmX2mm)裝入密封袋中，暫時無需使用的樣品可儲存于冰箱內(nèi)的冷凍層中(-18℃)。樣品前處理 用水、乙醇和甲酸(體積比為94:5:1)混合的提取液對切好的樣品(洋蔥皮：洋蔥球莖=1:4)進(jìn)行提取。

　　MEA實驗方法(1)經(jīng)查閱文獻(xiàn)，選取三個參數(shù)作為本實驗中的變量，即微波功率(w，瓦)，提取時間(min，分鐘)和固液比(樣品體積：提取液體積);

　　(2)變量選擇好后，先預(yù)估本實驗中三個參數(shù)的范圍，然后進(jìn)行預(yù)實驗，以確定微波儀器所能承受的功率和實驗容器所能承載的樣品體積;(3)考慮到參數(shù)彼此間的相互作用，為確定MAE的最優(yōu)提取條件，對實驗中的三個變量進(jìn)行析因設(shè)計，并進(jìn)行8組實驗。HPLC檢測方法 紫皮洋蔥中含有多種花青素的衍生物，而這些成分在HPLC中的保留值不同，因此在本實驗中應(yīng)用反相HPLC結(jié)合梯度洗脫法，來對紫皮洋蔥中的多種花青素衍生物進(jìn)行分離，并對洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化，最后進(jìn)行重復(fù)性和再現(xiàn)性實驗。

　　色譜條件 色譜柱：C-18(2.5μm，2.0mmX100mm)。流動相：A為5%的甲酸水溶液;B為5%的甲醇水溶液。檢測波長：520nm。流速：0.2ml/min。柱溫：30℃。經(jīng)0.45μm的濾膜過濾后，進(jìn)樣量30μL進(jìn)行色譜分析。

　　實驗結(jié)果 通過MAE預(yù)實驗，確定微波儀器的最大功率應(yīng)<300w，實驗容器所能承載的樣品體積應(yīng)<10mL，以防止實驗樣品的外溢和降解。通過完全析因設(shè)計的8組實驗，可以從提取液的顏色中推斷出較合理的參數(shù)組合，然后再繪制等值線圖對實驗結(jié)果進(jìn)行進(jìn)一步的分析，確定MAE的最優(yōu)條件為微波功率50w，固液比1:40，提取時間3分鐘。通過對不同洗脫梯度下色譜圖的分析對比，權(quán)衡其出峰時間和峰型效果，對洗脫梯度進(jìn)行優(yōu)化(見表1)，其中包含了前10分鐘的平衡時間和后20分鐘的沖洗時間。

　　表1 花青素的優(yōu)化洗脫梯度

　　選擇優(yōu)化梯度下的一個洗脫較快(15-16分鐘之間)且形狀良好的峰，進(jìn)行三次平行實驗，對每一次的該峰面積進(jìn)行計算，結(jié)果其相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)為2.38%，表明重復(fù)性和再現(xiàn)性良好。

　　呂冠薇 長春醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校