食品中黃曲霉毒素B1 檢測方法的發(fā)展
黃曲霉毒素是由黃曲霉菌和寄生曲霉菌代謝產生的致癌、致畸、劇毒化合物,廣泛分布于農作物的生長、收獲、儲運等各個階段,是一類由黃曲霉菌和寄生曲霉菌產生的劇毒代謝產物,主要有黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2,以及另外兩種代謝產物M1、M2。黃曲霉毒素B1污染的食物主要是花生、玉米、稻谷、小麥、花生油等糧油食品,且以南方高溫、高濕地區(qū)受污染最為嚴重。黃曲霉毒素耐熱,280 ℃才可裂解,故一般烹調加工溫度下難以破壞。因此,國際上的大多數國家均對食品中的黃曲霉毒素B1含量制定了限量標準。
在我國,國家質檢總局規(guī)定黃曲霉毒素B1是大部分食品的必檢項目之一。GB 2761-2005規(guī)定了玉米和花生及其制品、植物油、大米、其他糧食和嬰幼兒配方食品中黃曲霉毒素B1的限量值分別為20、10、10、5、5 μg/kg。為滿足不同的檢測需求,國內外科學家不斷的創(chuàng)新和改善黃曲霉毒素B1的檢測方法。根據檢測依據原理大致可分為質譜法和免疫學法。
高效液相色譜法(HPLC)
高效液相色譜法可以對黃曲霉毒素B1定量分析,其原理是:樣品中黃曲霉毒素B1通過提取,凈化等步驟進行富集,經過色譜柱分離后,通過測量色譜峰的面積進行定量。黃曲霉毒素免疫親和柱HPLC法采用單克隆抗體免疫技術,可特異地將黃曲霉毒素與其他真菌素分離出來,分離效率和回收率高。此方法已得到廣泛應用,并被美國官方分析化學家協(xié)會(AOAC)確認為官方檢測方法。該方法的檢測限可達0.02~5 ppb。
GB/T 18979-2003規(guī)定了免疫親和層析凈化高效液相色譜檢測食品中黃曲霉毒素B1的方法。樣品經過甲醇水混合溶液的提取,定量濾紙和玻璃纖維濾紙的過濾,通過免疫親和柱。免疫親和柱(IAC)是根據單克隆抗體與載體蛋白偶聯后將其填柱形成IAC,并與黃曲霉毒素抗原產生一一對應的特異性吸附關系制作成。試樣濾液通過免疫親和柱,濾液中的黃曲霉毒素與免疫親和柱產生特異吸附,用蒸餾水充分洗滌免疫親和柱將其他雜質等成分從柱中洗脫,再用甲醇將黃曲霉毒素洗脫下來。通過碘法柱后衍生增強測定時黃曲霉毒素的熒光強度。通過控制流動相的比例、流速、柱溫,將黃曲霉毒素的色譜峰與干擾峰分離,利用色譜峰面積進行定量測定。在一般實驗中,也有用三氟乙酸進行柱前衍生。高效液相色譜法是實驗室常用檢測黃曲霉毒素B1的方法,具有可靠性強,靈敏度高,定量分析準確的優(yōu)勢;但同時因為其所用檢測儀器設備昂貴,操作專業(yè)性強,因此推廣性不強,不適合進行快速檢測。
酶聯免疫法(ELISA)
酶聯免疫法檢測黃曲霉毒素B1的理論基礎是抗原抗體反應和酶與底物顯色反應,采用單克隆或多克隆抗體技術,具有特異性強、分析時間短、靈敏度高的特點。計融 等在生產抗總黃曲霉毒素單克隆抗體基礎上,利用間接競爭酶聯免疫法研制出具有中國自主知識產權的總黃曲霉毒素酶聯免疫檢測試劑盒,其最低檢出濃度為0.26 μg/kg,對樣品的最低檢出量為1.5 μg/kg,最低檢出限為0.02 μg/kg。但測試穩(wěn)定性較差,由于酶的不穩(wěn)定性,使得在實際檢測中易出現假陽性或假陰性的結果。
液相色譜串聯質譜法
一般來說,組織中黃曲霉毒素含量很低,而液相色譜串聯質譜法具有比高效色譜法更高的靈敏度和準確性,如今這種方法還很少使用在測定組織霉菌毒素含量中。該方法檢測限可達0.02~0.025 ppb。康紹英 等人將高效液相色譜與三重四級桿質譜串聯,建立4種黃曲霉毒素的定性定量分析方法。黃曲霉毒素在所測試濃度范圍內與峰面積呈線性關系,r>0.998,平均加標回收率在80.6%~100.6%,黃曲霉毒素B1最低檢出限為0.2 μg/kg。
金標免疫層析法
金標免疫層析法是利用納米金作為標記物的快速免疫診斷技術。該方法避免了復雜的前處理過程,檢測過程中無需進行試劑處理,適用于快速的現場檢測。研究結果表明采用該方法的最低檢出限可達2.5 ng/mL。
時間分辨免疫熒光分析法
時間分辨免疫熒光分析是近來發(fā)展起來的新型分析技術。該方法利用三價稀土離子與螯合劑及抗原形成螯合物作為標記物,利用時間分辨熒光光譜儀測試稀土離子的發(fā)光強度來檢測抗原量。黃飚 等采用該技術建立了高靈敏的黃曲霉毒素B1間接競爭免疫分析法,檢出限為0.01 μg/L,平均回收率可達88%。
隨著生物化學、分子生物學、免疫學等學科的發(fā)展,科學家不斷探索更快捷,準確,靈敏度高的檢測方法,以滿足不同的檢測需求。以金標法為代表的方法已被廣泛的應用。目前,黃曲霉毒素的檢測方法將繼續(xù)改進以獲得更高靈敏度,滿足快速檢測及同時檢測多種毒素的需求。
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