《食品安全導(dǎo)刊》刊號(hào):CN11-5478/R 國(guó)際:ISSN1674-0270

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肉制品中致病菌的檢測(cè)與熒光定量PCR方法

2017-02-11 12:07:31 來(lái)源: 食品安全導(dǎo)刊

評(píng)論0  我來(lái)說(shuō)兩句
    檢測(cè)肉制品中的致病菌是保障肉制品質(zhì)量安全、防止食源性疾病爆發(fā)的有效手段。PCR技術(shù)作為一種同時(shí)檢測(cè)多種病原菌的技術(shù),是檢測(cè)肉制品中致病菌的重要手段。此次主題由劉磊老師對(duì)肉制品致病菌的各種知識(shí)和熒光定量PCR方法進(jìn)行講解。
    食源性致病菌及其危害
    食源性疾病是指食品中致病因素進(jìn)入人體引起的感染性、中毒性等疾病,包括食物中毒。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì),約66%的食源性疾病由食源性微生物引起。據(jù)WHO(世界衛(wèi)生組織)估計(jì),全球每年有數(shù)十億人發(fā)生食源性疾病,每年美國(guó)大約有7600萬(wàn)人患食源性疾病。
    微生物種類主要分為兩類,其一為致腐性微生物,如蠟樣芽孢桿菌、枯草桿菌、大腸桿菌、變形桿菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、微球菌、真菌等,其二是致病性微生物,如李斯特菌、沙門氏菌、志賀氏菌、致病性大腸桿菌、鏈球菌、空腸彎曲菌、副溶血弧菌小腸結(jié)腸炎耶爾森菌
    在人們的日常生活中,肉制品是人體中微生物的一大重要來(lái)源。肉制品中的微生物的主要有三方面來(lái)源—動(dòng)物本身由于疾病或者創(chuàng)傷感染引入;屠宰、分割過(guò)程中引入的(水、腸道、呼吸道、工具、操作人員、空氣,鼠類及蠅蟲(chóng)等);制作過(guò)程中由配料帶入。
    致病菌限量標(biāo)準(zhǔn)及GB檢測(cè)方法
    我國(guó)關(guān)于致病菌的限量標(biāo)準(zhǔn)以國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)(GB)為主,主要包括GB 4789(檢測(cè)方法)、GB 29921(致病菌限量標(biāo)準(zhǔn))、產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)、衛(wèi)生規(guī)范GB 14811和接觸材料標(biāo)準(zhǔn)。除此之外,還有相關(guān)的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)(SN)、農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)(NY)和地方標(biāo)準(zhǔn)(DB)。肉制品中的國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)詳見(jiàn)表1,肉制品中致病菌的相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)如表2所示。
    食源性致病菌檢測(cè)方法及其選擇使用
    圖1以沙門氏菌為例,解釋了食源性致病菌的大致檢測(cè)流程。
    食源性致病菌的檢測(cè)方法大致可分為三類,即培養(yǎng)法、免疫法、PCR。培養(yǎng)法是致病菌檢測(cè)行業(yè)的金標(biāo)準(zhǔn),但是比較繁瑣,并且檢測(cè)周期長(zhǎng),同時(shí)要求新鮮樣本;免疫法同樣是行業(yè)金標(biāo)準(zhǔn),但是檢測(cè)結(jié)果存在人為差異;使用PCR方法具有非特異性干擾的特點(diǎn),并且檢測(cè)靈敏度很高。不同的檢測(cè)需求各自適應(yīng)著三種檢測(cè)方法,而每種檢測(cè)方法也有著選用的適合條件。檢測(cè)方法的選取大致需要考慮四點(diǎn),第一,檢測(cè)樣品:檢測(cè)方法均具有一定的適用范圍,例如檢測(cè)諾如病毒的ELISA試劑盒適用范圍為糞便、制定為檢測(cè)蔬菜的行標(biāo)則不適用;又如在沙門氏菌檢驗(yàn)中低菌量樣品可以一步增菌。第二,檢測(cè)項(xiàng)目:例如,致瀉性大腸桿菌適宜采用PCR方法檢驗(yàn),金葡腸毒素則適合采用免疫方法檢測(cè)。第三,樣品數(shù)量:檢測(cè)樣品數(shù)量大、建議采用免疫學(xué)方法,例如ELISA。第四,實(shí)驗(yàn)室預(yù)算:預(yù)算少,可以采用不需要儀器的免疫學(xué)方法或者恒溫PCR方法。
    MF熒光定量PCR產(chǎn)品
    實(shí)時(shí)熒光PCR是在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán),利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程,并對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法,而普通PCR則是借助DNA電泳對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)的終產(chǎn)物進(jìn)行半定量及定性分析。實(shí)時(shí)熒光PCR與普通RT-PCR相比,優(yōu)勢(shì)在于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)(在對(duì)數(shù)擴(kuò)增期)而不是重點(diǎn)檢測(cè),且其靈敏度更高,需要樣品也較少,特異性高,還能夠精確定量。此外,實(shí)時(shí)熒光PCR無(wú)需接觸EB等有害物質(zhì),檢測(cè)過(guò)程在密閉的反應(yīng)管中進(jìn)行,可以減少對(duì)環(huán)境中氣溶膠的污染,提高檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。
    就操作流程而言,MF熒光定量PCR產(chǎn)品操作可分為六步—取樣、樣品前處理、核酸提?。?min)、反應(yīng)體系配置(預(yù)制型)、擴(kuò)增檢測(cè)(1.5~2h)、結(jié)果判斷。從產(chǎn)品優(yōu)點(diǎn)看,MF熒光定量PCR也有六大優(yōu)勢(shì):第一、結(jié)果精確:采用獨(dú)特且高度保守等基因靶序列檢測(cè),特異性強(qiáng),靈敏度高,可達(dá)到10~100CFU/ML。第二、操作便捷:一次加樣、檢測(cè),減少人為誤差。第三、檢測(cè)快速:整個(gè)擴(kuò)增、檢測(cè)時(shí)間1.5~2h。第四、降低污染:封閉的體系中完成擴(kuò)增和實(shí)時(shí)測(cè)定,大大降低了污染的可能性。第五、精準(zhǔn)的控溫系統(tǒng):先進(jìn)的熱電制冷技術(shù),保證超高熱循環(huán)系統(tǒng)加熱,制冷迅速、穩(wěn)定,多溫度控制。第六、試劑盒通用性強(qiáng):適用于多種熒光定量PCR儀,不同探針和引物組合。
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